Nome do Projeto
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS INDUZIDOS NA MATRIZ DE COMPOSTOS SINTÉTICOS NA PELE SAUDÁVEL E DANIFICADA EM CAMUNDONGOS
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
16/07/2023 - 16/07/2027
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
Nosso grupo de pesquisa tem dedicado atenção especial ao estudo das propriedades farmacológicas de moléculas sintéticas contendo selênio. Nossos promissores resultados relacionados a compostos de selênio na dermatite atópica despertaram o interesse de uma indústria farmacêutica. Esta indústria farmacêutica tem buscado fármacos contendo selênio que possuam atividade anti-inflamatória em especial em modelos de cicatrização e doenças relacionadas à pele. Desta forma, compostos sintéticos inéditos contendo selênio serão avaliados em um modelo de dermatite atópica induzida por 2,4-dinitroclorobenzeno (DNCB). Para isto, serão utilizados camundongos fêmeas BALB/c. A pele dorsal dos camundongos será raspada para a retirada dos pelos e sensibilizada pela aplicação de DNCB. A sensibilização se dará pela aplicação de 200 µl de DNCB (0,5%) em acetona:óleo de oliva (3:1) na área raspada nos dias experimentais 1, 2 e 3. Nos dias 14 a 29 os animais receberão a aplicação de 100 µl de DNCB (1%) na orelha direita e nos dias 14, 17, 20, 23, 26 e 29 receberão esta aplicação na região dorsal (previamente raspada e sensibilizada). Os animais do grupo controle receberão apenas a aplicação de acetona: óleo de oliva (3:1). Nos dias 14 a 29, os animais receberão a aplicação tópica (0,5 g) dos compostos sintéticos ou hidrocortisona (creme comercial 1%) como controle positivo. Para aplicação tópica, os compostos serão incorporados em creme não iônico (pH 5,5; cor branca, homogênea) na concentração de 1 %. No 30º dia, os animais serão submetidos às seguintes avaliações: severidade da dermatite através de escores, comportamento de se coçar (stratching behavior), edema de orelha, análise histológica de orelhas e pele dorsal. Além disso, serão determinados nas orelhas e na pele dos animais os níveis de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS); atividade das enzimas Catalase e Mieloperoxidase; e os níveis de tióis não protéicos (NPSH). Parâmetros inflamatórios serão avaliados no sangue dos camundongos. Além disso, será investigada a ação dos compostos na síntese de colágeno. Os efeitos dos compostos inéditos sobre a pele serão estudados. Adicionalmente, se almeja investigar as potenciais vantagens alcançadas pela incorporação dos compostos orgânicos de selênio em nanocarreadores para administração cutânea e o efeito dos compostos em feridas.

Objetivo Geral

Avaliar o efeito de compostos sintéticos inéditos na DA induzida por 2,4-dinitroclorobenzeno (DNCB) em camundongos.

Justificativa

A dermatite atópica (DA) é uma doença alérgica, inflamatória e crônica que envolve uma inter-relação entre fatores ambientais, imunológicos, genéticos além da disfunção da barreira da pele (Udompataikul e Limpa-o-vart, 2012). Clinicamente, a DA caracteriza-se por lesões cutâneas eritematosas e pruriginosas em todo o corpo que causam forte impacto na qualidade de vida dos pacientes (Dalgard et al., 2015). Sobre o ponto de vista epidemiológico, a DA é uma doença que acomete principalmente crianças (20%) e 3% dos adultos (Kim et al., 2014; Nutten, 2015). Além disso, pacientes com DA têm tendência hereditária à secreção excessiva de anticorpos (mais especificamente imunoglobulina E (IgE)) a estímulos variados, como alérgenos, estresse emocional, variações de temperatura e umidade, infecções bacterianas da pele, alimentos ou tecidos, entre outros (Amaral et al., 2012).
Durante o curso da DA ocorrem disfunções da barreira epidérmica e imunológica. A disfunção da barreira é inata (particularmente em queratinócitos e células de Langerhans), com ativação de linfócitos T helper 2 (Th2). Na fase aguda da DA, os antígenos ativam as células de Langerhans (apresentadoras de antígenos), começando como uma resposta predominante de linfócitos Th2 (Peng e Novak, 2015). Além disso, as lesões cutâneas da DA são caracterizadas pela superexpressão de moléculas pró-inflamatórias tipo 2, como a interleucina (IL)-4, IL-5 (responsáveis por promover a migração de eosinófilos) e IL-13 (indutora de crescimento celular) (Heratizadeh e Werfel, 2016). Além disso, estudos demonstram que a IL-18 também está envolvida na fisiopatologia da DA, aumentando o recrutamento de eosinófilos para as vias aéreas e consequentemente expressando níveis aumentados de IL-4, IL-13 e histamina através de basófilos e mastócitos (Kumano et al., 1999; Yoshimoto et al., 2000). Na fase crônica, ocorre interação entre as células de Langerhans e macrófagos, com liberação de IL-1, que estimula linfócitos Th2 a produzirem mais IL-4, IL13, IL-5 e fator liberador de histamina (Weidinger, 2006).
Além disto, em relação à etiologia da doença acredita-se que há também uma associação da DA com uma alteração genética (Palmer et al., 2006). A descoberta da associação entre mutações do gene da filagrina (FLG) e a DA lançou uma nova luz sobre os mecanismos etiopatogênicos da doença (Palmer et al., 2006). A FLG é uma proteína responsável pela formação da camada córnea, que constitui a primeira barreira de proteção da pele, importante para que substâncias e microrganismos não penetrem a pele, além de impedir a perda de fluidos vitais, sendo formada e continuamente regenerada por queratinócitos, durante o processo de queratinização (Candi et al., 2005). Muitos pacientes portadores da DA apresentam defeitos na barreira cutânea, o que pode facilitar a penetração de alérgenos, micro-organismos e substâncias irritantes, que por sua vez estimulam a resposta imune na direção de um perfil Th2. O suporte para esta teoria vem da descoberta da associação da DA com mutações no gene da FLG, proteína essencial para a formação e manutenção da integridade da barreira cutânea (Irvine et al., 2011).
Frente ao que foi exposto, um dos problemas mais significativos em pacientes com DA é a coceira excessiva, uma vez que esta condição crônica provoca um agravamento do paciente com esta doença (Hashimoto et al., 2011). Uma das estratégias terapêuticas mais eficazes para melhorar a qualidade de vida dos pacientes com DA consiste em tratamentos capazes de aliviar a coceira associada ao prurido, mas infelizmente, devido às condições crônicas da coceira apresentarem etiologias muito diferentes, a maioria dos tratamentos tem resultados ruins e são acompanhadas de efeitos colaterais (Steinhoff et al., 2011). Por muito tempo, os corticosteroides tópicos, como a hidrocortisona, foram considerados a base dos tratamentos farmacológicos para DA, mas para muitos pacientes com esta doença nas fases moderada a grave, a eficácia dos tratamentos tópicos é limitada e a aplicação a longo prazo destes acarreta em efeitos colaterais (Ring et al., 2012). Além disto, as drogas imunossupressoras sistêmicas para DA são geralmente mais eficazes que os tratamentos tópicos, porém têm um potencial substancial para efeitos tóxicos mais graves (Ring et al., 2012; Sidbury et al., 2014; Roekevisch et al., 2014). Assim, o tratamento, na melhor das hipóteses, consegue controlar os sintomas em vez de curar. Desta forma, existe uma grande necessidade de desenvolver um tratamento e novas estratégias eficazes para a DA.
A busca por novos agentes que possam ser efetivos na DA se intensificou nos últimos anos. De fato, a síntese e a triagem biológica de compostos derivados de selênio podem ser consideradas uma área de pesquisa relevante, sendo que a síntese desses já revelou substâncias com grande potencial farmacológico, tais como: antioxidante, antinociceptivo e anti-inflamatório (Pinz et al, 2016; Vogt et al., 2018), ansiolítico (Reis et al., 2017), proteção contra o comprometimento da memória (Da Silva et al., 2017), redução das lesões cutâneas em modelo de DA (Voss et al., 2018), entre outros.
Com base nestas considerações, este estudo é motivado pelos seguintes fatores: i) impacto da DA sobre a qualidade de vida do portador desta doença; ii) aumento das estimativas de incidência de DA em crianças e adultos; iii) limitação no uso dos tratamentos já existentes; iv) necessidade da busca por um novo tratamento capaz de tratar a doença e não só os sintomas; v) potencial farmacológico de compostos de selênio; e vi) a necessidade de estudos que avaliem a DA em relação aos seus fatores genéticos, imunológicos e disfunção na barreira epidérmica.

Metodologia

Serão utilizados camundongos fêmeas BALB/c (2 meses de idade) provenientes do Biotério Central da UFPel. Este projeto foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da UFPel (23357-2018).
A pele dorsal dos camundongos será raspada para a retirada dos pelos e sensibilizada pela aplicação de DNCB (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) conforme descrito previamente (CHAN et al., 2013). A sensibilização se dará pela aplicação de 200 µl de DNCB (0,5%) em acetona:óleo de oliva (3:1) na área raspada nos dias experimentais 1, 2 e 3. Nos dias 14 a 29 os animais receberão a aplicação de 100 µl de DNCB (1%) na orelha direita e nos dias 14, 17, 20, 23, 26 e 29 receberão esta aplicação na região dorsal (previamente raspada e sensibilizada). Os animais do grupo controle receberão apenas a aplicação de acetona: óleo de oliva (3:1). Nos dias 14 a 29, os animais receberão a aplicação tópica (0,5 g) dos compostos sintéticos ou hidrocortisona (creme comercial 1%) como controle positivo. Para aplicação tópica, os compostos serão incorporados em creme não iônico (pH 5,5; cor branca, homogênea) na concentração de 1 %. No 30º dia, os animais serão submetidos aos testes descritos abaixo:
1. Avaliação da severidade da dermatite: A severidade da dermatite na pele dorsal será avaliada 48 h após cada desafio de acordo com critério descrito previamente (LEUNG et al., 1990). O escore de avaliação será: 0 – nenhum, 1 – leve, 2 – moderado, 3 – severo, para cada um dos quatro sinais de sintomas (eritema/hemorragia, edema, escoriação/erosão, ressecamento).
2. Comportamento de se coçar (stratching behavior): Será mensurado o tempo que o camundongo gasta coçando o nariz, as orelhas e a pele dorsal com suas patas por 20 min no último dia de experimento (dia 30) (KIM et al., 2014).
3. Edema de orelha: Será determinado através da diferença de peso entre a orelha direita e a esquerda (LIN et al., 2015).
4. Análise histológica: as orelhas e a pele dorsal serão fixadas em 10 % de formol, embebidas em parafina e posteriormente seccionadas em seções de 6 mm. Para demonstrar mudanças morfológicas, a infiltração de células inflamatórias e a estimulação da síntese de colágeno, essas seções serão coradas com hematoxilina/eosina ou Tricromo de Masson e posteriormente examinados sob um microscópio óptico.
5. Dosagens bioquímicas: Serão determinados nas orelhas e na pele dos animais os níveis de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (OKHAWA et al., 1979); atividade das enzimas Catalase (CAT) (AEBI, 1995) e Mieloperoxidase (MPO) (SUZUKI et al., 1983); e os níveis de tióis não protéicos (NPSH) ( (ELLMAN, 1959).
6. Parâmetros inflamatórios: A determinação da interleucina (IL)-1, IL-6 e fator de necrose tumoral-α (TNF-α) no sangue dos camundongos será realizada usando os kits de ELISA comercial (eBIOSCIENCE, San Diego, EUA).
7. Outras determinações: Para a determinação dos níveis de proteínas relacionadas à regeneração da pele, será utilizado uma alíquota do lisado total da amostra (20 µg de proteína), a qual será submetida ao ensaio de Western Blotting (Imbernon et al., 2013). Os níveis de proteínas serão normalizados por β-actina. As análises quantitativas serão realizadas utilizando os anticorpos específicos.
Adicionalmente, serão desenvolvidos e caracterizados nanocarreadores contendo os compostos orgânicos de selênio inéditos quanto às propriedades físico-químicas gerais. Ainda, hidrogéis e filmes poliméricos a partir dos nanocarreadores contendo os compostos orgânicos de selênio inéditos serão preparados. Será estimado o perfil de permeação dos compostos nas diferentes camadas da pele e as propriedades de biodistribuição dos mesmos. Por fim, será avaliada a performance farmacológica dos compostos orgânicos de selênio inéditos associados a nanocarreadores em modelo de dermatite atópica e em feridas a partir de sua administração cutânea.
Os dados obtidos serão expressos como média ± erro padrão. Será avaliada a distribuição dos dados quanto a normalidade para definição do teste estatístico a ser utilizado. Os resultados serão avaliados através do Graphpad Prism® 5. Valores de p < 0,05 serão considerados significativos.

Indicadores, Metas e Resultados

Tendo em vista o design experimental delineado, espera-se melhor elucidar o envolvimento de marcadores oxidativos e inflamatórios na dermatite atópica e comorbidades associadas, tendo em vista a relação entre os processos inflamatórios cutâneos e o impacto a nível central. Ainda, pretende-se identificar uma nova abordagem terapêutica para o tratamento desta condição, explorando o preparo de dispositivos sólido e semissólido de base nanotecnológica a ser aplicado por uma via de administração estratégica para a condição, primando pela inovação científica e tecnológica. Com o desenvolvimento desta proposta almeja-se envolver alunos de iniciação científica e pós-graduação, gerando trabalhos de conclusão de curso, dissertações e teses relacionadas com o tema. Pretende-se também realizar o depósito de patentes e publicar os resultados obtidos em periódicos científicos de abrangência internacional.
A presente proposta tem como prospecção continuar aumentando a qualidade dos artigos publicados, contribuir para a formação de recursos humanos de qualidade, aperfeiçoar a qualificação de jovens doutores por meio da atuação na pesquisa em Bioquímica e Bioprospecção, com ênfase em nanociência, desenvolver uma nova estratégia terapêutica e consolidar as parcerias estabelecidas com pesquisadores nacionais e internacionais, bem como com a indústria farmacêutica. Ainda, espera-se que a pesquisa a ser realizada contribua para melhorar a qualidade de vida dos pacientes acometidos pela dermatite atópica e comorbidades e motive jovens cientistas a continuarem preocupando-se com questões científicas e sociais.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
ANA PAULA BONATO WILLE
BRIANA BARROS LEMOS
CRISTIANE LUCHESE1
ETHEL ANTUNES WILHELM1
KETLYN PEREIRA DA MOTTA
MARCIA FOSTER MESKO1

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