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Vacas leiteiras com alto valor genético necessitam de maiores quantidades de concentrados na formulação de sua dieta para conseguir expressar a capacidade máxima de produção. Por consequência, haverá alteração do PH no ambiente ruminal. Em casos de vacas secas que vão iniciar a lactação, é um período onde ocorre uma mudança brusca na alimentação, devido a inclusão de dietas com alto teor forrageiro (volumoso) e concentrados. Como forma de minimizar os impactos no ambiente ruminal e os prejuízos produtivos destes animai, é necessário a utilização de aditivos nutricionais que atuem no tamponamento do rúmen.

Instalações - O experimento será realizado em uma fazenda comercial produtora de leite, no município de Turuçu, RS, com sistema semi-extensivo, onde as vacas tem acesso a pastagem e suplementação de dieta total.

Recursos Humanos - Tanto para a condução dos procedimentos experimentais, quanto para a análise técnica dos resultados, estará disponível toda a equipe do NUPEEC, composta por professores doutores em Veterinária e Zootecnia, além de Médicos Veterinários e Zootecnistas que realizam pós-graduação
(residência, mestrado e doutorado) junto à equipe e alunos de graduação.

Experimento - Serão acompanhadas 26 vacas leiteiras da raça holandesa em lactação (entre 100 e 150 dias em lactação), saudáveis, com escore corporal (ECC) e dias de lactação semelhantes.
O período experimental será composto de 2 períodos de 28 dias, sendo realizado em modelo de crossover, com um intervalo de 14 dias entre as réplicas. No início do experimento (D-7) os animais serão divididos em dois grupos Cotribá e Controle. Neste dia será realizada uma coleta basal de sangue, fluido ruminal, urina e leite, além da amostragem da dieta. No (D0) será realizada o início da suplementação dos tratamentos, incluindo uma nova coleta de sangue, fluido ruminal, urina, amostras de leite e dieta, assim como no decorrer de cada semana. O período de suplementação dos tratamentos ocorrerá no período de 21 dias, onde ambos os grupos receberão a mesma dieta, diferindo apenas pela adição de tamponante controle ou tamponante Cotribá na quantidade recomendada pelo fabricante.

Medidas de Desempenho - Ao longo do período experimental serão realizadas a medição da produção de leite individual dos animais 2 vezes ao dia no momento de cada ordenha e a análise de composição de leite 1 vez por semana nos dias (-7, 0, 7, 14, 21) de cada período, afim de analisar os níveis de proteína, gordura, lactose, extrato seco desengordurado, sólidos totais, nitrogênio ureico, CBT e CCS. Também serrão realizadas coletas semanais de sangue, para avaliação dos níveis séricos de Albumina e Proteína C Reativa, proteínas de fase aguda; Urina para avaliação do pH uriário, presença de corpos cetônicos e macrominerais; Fezes para futura avaliação de microbioma digestivo; e Fluido ruminal para avaliação de motilidade de portozoários, redução de azulde metileno, tempo de sedimentação e flutuação. Além disto no D14 serão coletadas três amostras de fluido ruminal a fim de avaliar o comportamento do pH ruminal nas horas -2, 2 e 6 em relação ao fornecimento da dieta.

Coleta da dieta e avaliação da taxa de lotação - Os animais serão manejados sob pastoreio rotativo com taxa de lotação (kg ha-1 de peso vivo (PV), visando a meta de mesma oferta de forragem (OF) nos tratamentos pela equação: OF (kg MS/kg PV) = Massa de forragem (kg/ha) / Peso vivo animal (kg/ha), expressa de acordo com Sollenberger et al. (2005). A variável da taxa de lotação animal (kg PC ha-1), será calculada pelo peso total dos animais em relação ao número de ha (LOWMAN et al., 1973). As avaliações da estrutura da vegetação no experimento, serão realizadas semanalmente, conforme na figura 2, onde a altura do pasto (ALT, cm), será mensurada. A massa da forragem MF (MF, kg ha-1 de MS), será estimada realizada por meio de cortes da massa de forragem total, acima do mantilho, contida no quadro metálico de 0,25m². As amostras serão acondicionadas em estufa de circulação de ar forçado com 55ºC, até peso constante para obter a matéria seca. Assim, serão calculadas regressões lineares (y=a + bx) entre o peso das amostras e ALT, para a estimativa de massa de forragem a partir das demais alturas obtidas. As análises qualitativas da pastagem serão obtidas a partir da coleta da forragem aparentemente consumida pelos animais, no mesmo período em que serão realizados o período experimental, além disso semanalmente também será coletado uma amostra da dieta total fornecida como suplementação aos animais. Todas as amostras obtidas serão submetidas a procedimentos laboratoriais.

Coleta de sangue - A coleta de sangue será realizada semanalmente através do complexo arteriovenoso da coccígea em um tubo sem anticoagulante. As amostras serão encaminhadas para o Laboratório de Bioquímica do Núcleo de Pesquisa, Ensino e Extensão em Pecuária (NUPEEC), na Universidade Federal de Pelotas, onde serão centrifugadas e armazenadas para posteriores análise de proteína C reativa (PCR) e albumina (ALB).

Coleta de Urina - A coleta de urina será realizada semanalmente coletando 50ml através da micção natural por massagem perineal. As amostras serão encaminhadas para o Laboratório de Bioquímica do Núcleo de Pesquisa, Ensino e Extensão em Pecuária (NUPEEC), na Universidade Federal de Pelotas, onde serão armazenadas para posteriores análise de pH, presença de corpos cetônicos e macrominerais como Na, Mg, Ca, K.

Coleta de Fluído Ruminal - O fluido ruminal será coletado semanalmente através de sonda orogástrica, sendo realizados os testes de sedimentação/ flutuação, oxirredução (redução do azul de metileno 0,02%), avaliação da concentração dos protozoários e do pH ruminal, além disso, no dia 14 de cada período experimental, será realizada a avaliação do comportamento do pH em relação a alimentação das vacas nas horas -2, 2 e 6.

Coleta de Fezes - Semanalmente será coletado fezes dos animais para realizar avaliações de microbioma intestinal, afim de identificar a presença de microrganismos e a proporção destes em uma amostra de fezes.

Análise estatística - Para as análises estatísticas, serão realizados previamente, testes de normalidade dos dados de todas as variáveis, em que será adotado grau de confiança de 0,05 para o teste Shapiro-Wilk. Os dados serão submetidos à análise de variância (ANOVA) e teste F pelo Mixed Procedure (PROC MIXED) do pacote estatístico SAS (2001). As médias serão estimadas utilizando-se o LSMEANS, e a comparação entre as mesmas, realizada por meio da probabilidade da diferença (PDIFF) pelo teste Tukey, a 5% de significância. As interações entre tratamento X período, serão desdobradas quando significativas (p<0,05). A regressão multivariada será obtida através do PROC STEPWISE do SAS (SAS, Inst., Inc., Cary, USA), para a construção de modelagens.

Analises Bromatológicas - As análises qualitativas da dieta serão submetidas a procedimentos laboratoriais sendo avaliados os conteúdos de teores de matéria seca (MS), por secagem, a matéria orgânica (MO) e matéria mineral (MM) (AOAC método no. 22.010 e no. 7.010, 1975), proteína bruta (PB) pelo método de Kjeldahl (AOAC método no. 2.036, 1960 e no. 2049, 1975); fibra em detergente neutro, cinzas e proteína (FDNcp), fibra em detergente ácido (FDA), corrigidas por cinzas e lignina em detergente ácido (LDA) segundo Van Soest & Robertson (1991). O Nitrogênio Insolúvel em detergente Neutro (NIDN) e o Nitrogênio Insolúvel em Detergente Ácido (NIDA) serão determinados de acordo com Licitra et al. (1996), e utilizados no cálculo do teor de proteína degradável no rúmen (PDR) pelo modelo proposto por Orskov & Mcdonald (1979). As amostras serão secas em estufa com ventilação forçada a 55 ºC por 72 horas, a pós esta etapa as mesmas foram moídas em moinho tipo Willey em peneira de 1 mm. A quantificação concentração de proteína bruta fecal (PBf; g/kg MO) e fibra em detergente neutro fecal (FDNf: g/kg MO).

Analises sanguíneas - Os níveis de albumina e proteína C Reativa serão analisadas por colorimetria utilizando kits enzimáticos (Labtest Diagnóstica S.A., Brasil) e para a leitura, será usado o espectrofotômetro de luz visível (FEMTO 700Plus, FEMTO Indústria e Comércio de Instrumentos, São Paulo, Brasil).

Analises de Leite - As amostras foram preservadas (Broad Spectrum Microtabs II, D&F Control Systems Inc.) e armazenadas a 4°C até serem analisadas. As concentrações de gordura do leite, proteína, lactose, uréia, caseína, CCS e CBT serão determinadas por um laboratório comercial de leite, usando análise infravermelha (CombiFoss 5000, Foss Analytical).

Análises de Fluido ruminal - O exame do líquido ruminal será realizado imediatamente após a coleta, para diminuir a contaminação pela saliva nas amostras e minimizar a interferência nos valores do pH, as primeiras 200ml de liquido devem ser desconsiderados, sendo utilizados os volumes subsequentes. A mensuração do pH do líquido ruminal será realizada mediante a utilização de um phmetro digital portátil, previamente calibrado. Logo após, será dispostos 20ml de líquido ruminal em duas provetas de 50ml, para se avaliar as características de cor, odor, consistência e a prova de redução do azul de metileno, onde se adicionou 1ml do azul de metileno a 0,03% em 20ml de suco. Foi considerado suco ruminal com atividade bacteriana “ativa” o que obteve um tempo de redução do azul de metileno em até 3 minutos, “média” naquele que obteve a redução de 3 a 6 minutos e “reduzida” no qual foi constatado tempo superior a 6 minutos. Quanto a avaliação microbiológica, os protozoários serão avaliados pela densidade, motilidade, porcentagem de pequenos, médios e grandes e contagem total. Para a avaliação de AGV uma amostra de 10ml deve ser armazenada em H2 SO4 50% para posterior análise.

Análise de Urina - A mensuração do pH urinário será realizada com auxílio de pHmetro digital logo após a coleta das amostras, em seguidas as amostras serão armazenadas para posteriores análises de minerais e corpos cetônicos.

Análise de Microbioma Intestinal - As mostras de fezes serão coletadas diretamente da ampola retal das vacas semanalmente para posterior análise de crescimento bacteriano.

Através da medição da produção, coleta e análise da composição de leite das vacas do experimento espera-se que os animais que receberem tratamento com o aditivo da empresa Cotribá produzam maior quantidade de leite e de melhor qualidade, devido ao fato do produto em questão ser eficiente no que diz respeito a manutenção da saúde do ambiente ruminal e por consequência de todos sistemas biológicos. Através da utilização das análises de urina, fezes, sangue e fluído ruminal será analisado quanto o produto testado contribui para a saúde e o desempenho das vacas em lactação. As avaliações de taxa de lotação, oferta forrageira e dieta serão ferramentas de extrema importância para monitoramento e avaliação de atendimento as exigências nutricionais das categorias animais envolvidas no experimento no que diz respeito a quantidade e qualidade de nutrientes fornecidos.