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Há inúmeras evidências de que inflamações tanto a nível periférico quanto central, decorrentes de infecções por patógenos, contribuem para o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, que é apoiado por associações entre vacinação e diminuição do risco de desenvolver Doença de Alzheimer. Portanto, o lipopolissacarídeo (LPS) vem sendo usado com um indutor de neuroinflamação, para o estudo de reatividade glial, bem como, para a prospecção de compostos com potencial terapêutico para inúmeras doenças neurodegenerativas.
Neste contexto, a pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos para tratamento de doenças neurodegenerativas é imperativo, mesmo sob todas as dificuldades presentes. A abordagem terapêutica atual não é suficiente para alterar o curso dessas doenças, conseguindo apenas lentificar o processo de degeneração tecidual. Como ferramenta, o LPS consegue induzir um estado neuroinflamatório que permite utilizar modelos in vitro e in vivo a fim de identificar eventos moleculares com potencial terapêutico.
O uso da tiazolidinona como um molde químico, podendo alvejar diversos alvos biológicos em função dos substituintes, é extremamente útil na prospecção de compostos multialvo. No presente projeto, a DS12 será empregada a fim de avaliar seu efeito na sinalização colinérgica, estresse oxidativo e reatividade glial em modelos in vitro e in vivo de neuroinflamação induzida por LPS.

1. Síntese de 2-(4-(metiltio)fenil)-3-(3-(piperidin-1-il)propil)tiazolidin-4-ona (DS12)

O composto DS12 será sintetizado no Laboratório de Química Aplicada a Bioativos (LaQuiaBio), segundo método de Da Silva e colaboradores (2016), sendo posteriormente confirmado e caracterizado por CG-EM e RMN de 1H e 13C.

2. Animais

Os procedimentos e protocolos aplicados foram aprovados pelo Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de Pelotas (UFPel), sob número de protocolo CEUA 038629/2021-23.

3. Protocolo Experimental in vitro

O cultivo primário de astrócitos será conduzido conforme Gottfried e colaboradores (1999), com modificações. Serão utilizados ratos machos Wistar, com 1 a 2 dias de idade, os quais serão submetidos a eutanásia e o encéfalo será removido e mantido em solução de CMF, solução tampão livre de cálcio e magnésio, resfriada. O córtex cerebral será isolado, transferido para um tubo de 15 mL e homogeneizado mecanicamente por pipeta. O pool celular será centrifugado a 1000 rpm por 10 minutos e o sobrenadante será descartado. As células serão semeadas em uma densidade de 3 x 105 células por poço em uma placa de 6 poços, previamente tratadas com poli-L-lisina. As placas cultivadas serão mantidas em incubadora de CO2 por 4 horas para posterior troca de meio. Após isso, as trocas de meio serão realizadas a cada cinco dias até maturação celular, cerca de 20 dias. As condições de cultivo serão de 37 ºC com concentração de CO2 de 5% e umidade controlas
Os astrócitos serão expostos ao LPS (1 µg/mL) durante 3 horas e em seguida serão submetidos ao tratamento com diferentes concentrações do composto DS12 (10, 25, 50 e 100 µM) por 24h ou 48h. As células mantidas apenas em DMEM 10% de SFB serão consideradas como controle. Ao término do tempo de incubação deste protocolo o sobrenadante e o lisado das células serão armazenados para posteriores análises bioquímicas. Com o objetivo de avaliar se a via colinérgica está envolvida no efeito do composto DS12, astrócitos também serão tratados com escopolamina (um antagonista de receptores muscarínicos) e mecamilamina (antagonista de receptor nicotínico). Neste protocolo serão avaliados parâmetros de viabilidade e proliferação celular, imunomarcação de reatividade glial, morte celular, níveis de citocinas, western blot de NLRP3, Caspase-1, GSDMD, C3, S100A10, CD82 e CD206 e parâmetros de estresse oxidativo e atividade da acetilcolinesterase.

4. Protocolo experimental in vivo

Os camundongos serão tratados por sete dias consecutivos com LPS e o composto DS12. O LPS será dissolvido em solução fisiológica e administrado nos animais por via intraperitoneal (ip), enquanto que a DS12 será dissolvida em óleo de canola e administrada nos animais por via oral. Os animais serão divididos em quatro grupos (n=12 animais cada): I) grupo controle, tratado com solução salina (i.p.) e óleo de canola por gavagem (gv); II) grupo LPS, desafiado com LPS (250 µg/kg via i.p.) e tratado com óleo de canola (via gv); III) Grupo DS12-5, desafiado com LPS (250 µg/kg via ip) e tratado com DS12 na dose de 5 mg/kg (via gv) e IV) DS12-10, desafiado com LPS (250 µg/kg via ip) e tratado com DS12 na dose de 10 mg/kg (via gv). Durante o protocolo serão registrados o consumo alimentar e peso dos animais. No quinto, sexto e oitavo dias serão realizados os protocolos comportamentais para avaliação de memória. Findado o período de tratamento, no oitavo dia, os animais serão submetidos a eutanásia e sangue, córtex cerebral, hipocampo, estriado, fígado e rim serão coletados. Em tecido cerebral serão avaliados: parâmetros de estresse oxidativo, atividade da acetilcolinesterase, expressão de enzimas e receptores purinérgicos, níveis de citocinas e imunomarcação de reatividade glial. No fígado e rim serão avaliados parâmetros de estresse oxidativo e no soro parâmetros bioquímicos séricos.


5. Análise estatística
As análises estatísticas serão ANOVA de uma via seguida do teste de Tuckey para comparações múltiplas, através programa GraphPad. Os resultados serão expressos como média ± erro padrão e valores serão considerados significativos quando P < 0,05.

Espera-se que os resultados deste trabalho possam esclarecer os mecanismos envolvidos nos efeitos terapêuticos associados a tiazolidinonas DS12. Pretende-se demonstrar um efeito biológico promissor e multialvo deste composto com significativa repercussão técnico-científica na área aplicada a novos prováveis fármacos dentro do contexto da neuroinflamação.
Ainda, é importante ressaltar que uma parte deste projeto será desenvolvida pelo doutorando Fernando Lopez Alvez durante seu doutorado sanduíche na Universidade de Lisboa, em Portugal, sob orientação da professora Claudia Valente. Desta forma, espera-se que essa colaboração auxilie no desenvolvimento de habilidades e competências que promovam e aprimorem a pesquisa desenvolvida.