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O Rio Grande do Sul tem sua economia baseada em um pequeno número de atividades agrícolas, porém com grande volume de produção. Entre estas estratégias estão gramíneas como o arroz e a aveia. O arroz é uma cultura de grande importância no estado, ocupando áreas de 800 mil a 1 milhão de hectares nas terras baixas da Região Sul. A aveia e o trigo têm surgido como alternativas para terras baixas, tendo se mostrado tolerantes a solos encharcados. Programas locais de melhoramento permitiram modificações críticas para o desempenho de cultivares de aveia e trigo, enfocando mudanças em ciclo, estatura e suscetibilidade a moléstias. Estas melhorias resultaram num aumento considerável do potencial de rendimento da aveia e do trigo nas últimas décadas. Esta melhoria toma maior importância quando se analisa a tendência de globalização da economia mundial e a necessidade de um produto brasileiro mais competitivo face às exigências do mercado comum do Mercosul. Outro fator importante é a qualidade do produto gerado, isto é, devemos nos preocupar em produzir mais grãos para reduzir custo e ao mesmo tempo, com maior qualidade para atender as exigências do mercado.
O arroz, além da sua importância econômica e social, é considerado uma espécie modelo para estudos genético-moleculares. Entre os cereais, o arroz é que possui as melhores características para responder aos esforços de enriquecimento dos mapas moleculares e, consequentemente, ser um modelo para a genômica. Portanto, os genótipos de arroz sensíveis e tolerantes a estresses abióticos identificados no trabalho serão materiais úteis para estudos genômicos complementares, clonagem, ação e regulação gênica, expressão diferencial e sequenciamento dos caracteres relevantes no estudo. Em virtude das elevadas relações de sintenia entre o genoma do arroz e o genoma dos demais membros da família das gramíneas, os resultados obtidos neste estudo poderão ser empregados no melhoramento de outros cereais. Estes conhecimentos poderão subsidiar avanços na área de melhoramento vegetal, gerando informações sobre o comportamento das culturas frente as condições de estresse como seca e alagamento, auxiliando o desenvolvimento eficiente de novas cultivares.

Avanço de geração e caracterização morfológica em genótipos de arroz, trigo e aveia

O experimento de linhagens mutantes M5 de arroz, derivadas da irradiação de sementes da cv. BRS Pampeira com raios Gama (60Co) nas doses de 250 Gy e 300 Gy, e cultivares será conduzido à campo na Estação Experimental Terras Baixas (ETB), pertencente à Embrapa Clima Temperado, no município do Capão do Leão-RS. A semeadura das linhagens mutantes será realizada de forma manual. O delineamento experimental utilizado será de blocos aumentados de Federer com testemunhas intercalares. Como testemunha será utilizada a cultivar BRS Pampeira, intercalada a cada 100 famílias mutantes. As plantas serão avaliadas para os seguintes caracteres: estatura de planta, número de perfilhos, número de panículas, comprimento da panícula, peso de panícula, número de grãos cheios/panícula, número de grãos vazios/panícula, peso de grãos cheios/panícula, peso de 1000 grãos e rendimento de grãos. Cabe salientar que para a seleção das famílias mutantes serão consideradas, além da produtividade, em relação a testemunha BRS Pampeira, a precocidade e tolerância ao estresse por deficiência hídrica.
Os experimentos de avaliação de linhagens e cultivares de aveia e trigo será realizado em campo experimental localizado no CAP (Centro Agropecuário da Palma), pertencente à Universidade Federal de Pelotas (UFPel).
A semeadura da aveia será realizada de forma mecanizada em sistema convencional, com uma densidade de 300 sementes viáveis m-². O delineamento experimental usado será de blocos casualizados com quatro repetições, as parcelas serão constituídas por 5 linhas de 5 metros de comprimento e 0,17 metros de espaçamento entre linhas, sendo que a colheita e as avaliações serão feitas apenas nas três linhas centrais, eliminando o efeito de borda, totalizando em uma área útil de parcela de 2,55 m². Os tratos culturais serão efetuados com base nas recomendações técnicas da cultura da aveia. Serão avaliados os seguintes caracteres: rendimento de grãos, peso do hectolitro, massa de mil grãos, comprimento do ciclo vegetativo, reprodutivo e total, estatura de planta, acamamento de plantas, ferrugem da folha, ferrugem do colmo e mancha foliar.
Para o trigo serão avaliadas linhagens e cultivares recomendados para cultivo na região sul do Brasil. A densidade de semeadura será o equivalente a 300 sementes viáveis por metro quadrado de área. Cada constituição genética será semeada em parcelas com área de 5m2, constituídas por cinco linhas de cinco metros de comprimento, com espaçamento entre linhas de 0,20m e uma linha em branco entre as parcelas. O experimento será conduzido em solo adubado de acordo com as Recomendações da Comissão Brasileira de Pesquisa de Trigo e Triticale. Serão avaliados os seguintes caracteres: rendimento de grãos, peso médio de grãos, número de espigas por metro linear, número de grãos por espiga e data de florescimento. Também será realizado teste de germinação na espiga e índice de queda úmido, sendo que as espigas utilizadas serão marcadas com fitas, no período onde estiverem próximas a 50% de florescimento. Para cada genótipo a ser caracterizado serão colhidas 100 espigas. Serão feitas a seguintes avaliação no laboratório: percentual de grãos germinados e não germinados, índice de queda seco, percentual de grãos dormentes e de grãos mortos. Também serão feitos experimentos de avaliação de severidade de brusone a campo. A escala fenotípica de severidade da doença utilizada, será de acordo com Maciel et al. (2010). E serão feitas avaliações de incidência e severidade aos 10, 20 e 30 dias após as inoculações.

Mapeamento associativo

Para a genotipagem em larga escala de SNPs será utilizada a tecnologia de sequenciamento de nova geração denominada genotipagem por sequenciamento (GBS, Genotyping by sequencing). O DNA genômico será enviado e analisado pelo Instituto de Diversidade Genômica da Universidade de Cornell (Buckler Laboratory). Neste instituto serão construídas as bibliotecas genômicas e conduzido o GBS. A análise de associação entre os marcadores SNPs e os caracteres de interesse para tolerância a estresses abióticos e/ou caracteres de interesse agronômico será realizada pelo programa computacional TASSEL versão 3.0 standalone (Bradbury et al., 2007), utilizando-se o módulo Mixed Linear Model (MLM).


Técnica de TILLING em famílias mutantes de arroz visando à identificação de famílias tolerantes a estresses abióticos

O material vegetal utilizado no estudo serão genótipos mutantes de arroz em geração M5, obtidos através da radiação gama ( 60Co), nas doses de 250Gy e 300Gy de sementes da cultivar BRS Pampeira, no Centro de Energia Nuclear na Agricultura da Universidade de São Paulo.
Para a análise das famílias mutantes através da técnica de TILLING serão analisadas 1000 famílias, em 125 pools de oito famílias, para a presença de mutações no gene de interesse, relacionado com a resposta ao estresse abiótico (como seca, ferro, salinidade) em arroz. O DNA será extraído a partir de amostras foliares de cada pool de famílias, por meio do método de extração CTAB 2%, descrito por Saghai-Maroof et al. (1984). As reações de PCR dos pools de DNA e do controle (genótipo não mutado) serão realizadas em um volume final 13 μl contendo DNA, GoTaq Green Master Mix (Promega) e primer. Serão confeccionados primers específicos para a região de interesse. A amplificação e o tamanho dos produtos serão verificados por eletroforese em gel de agarose 2% corado com GelRed. A detecção da mutação será realizada com o kit SURVEYOR®Mutation Detection Kits for Standard Gel Electrophoresis (Transgenomic) de acordo com as especificações do fabricante. Os produtos da digestão serão verificados por eletroforese em gel de agarose 2% corado com GelRed. Os pools cujas famílias apresentem bandas distintas à do produto de PCR do tipo selvagem possuem mutações no gene de interesse e, portanto, a identificação da família mutante dentro do pool será a etapa seguinte da análise, realizada pela amplificação do gene de interesse em plantas individualizadas.

Perfil transcricional de genes envolvidos com estresses abióticos em arroz

Será avaliado o perfil transcricional dos genes envolvidos em diferentes estresses abióticos (salinidade e frio) em plantas de arroz. As sequências correspondentes a região codificadora de cada gene serão obtidas no banco de dados de arroz RAP-DB (Rice Annotation Project Database – https://rapdb.dna.affrc.go.jp/). Os primers serão desenhados utilizando o programa Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi), obedecendo aos seguintes parâmetros: fragmento amplificado com tamanho de 50-150pb, temperatura de anelamento ~60ºC, conteúdo de GC de 40-60%.
A análise de expressão via PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR) será conduzida de acordo com o manual MIQE (Bustin et al. 2009) utilizando equipamento 7500 fast real-time PCR system (Applied Biosystems). A validação buscando determinar a eficiência de amplificação e a especificidade de cada primer será realizada utilizando cinco diluições de cDNA. Serão utilizados apenas os primers que apresentarem eficiência de 90 a 110% e com apenas um pico na curva de dissociação (específicos). Os ensaios de expressão gênica serão conduzidos utilizando o corante SYBR Green mix. Três replicatas biológicas independentes de cada amostra e três replicatas técnicas de cada replicata biológica serão utilizadas para a análise em RT-qPCR. A quantificação será conduzida de acordo com o método ΔΔCt (Livak e Schmittgen 2001). Além dos primers correspondentes aos genes alvo, serão testados cinco primers de genes de referência/normalizadores e os dados de expressão serão submetidos à análise de estabilidade no programa DataAssist™ v3.0 Software. Após análise os três genes que apresentarem valores de score abaixo de 1 serão utilizados para normalizar os dados de expressão dos genes alvo.

Resultados esperados:
Espera-se obter linhagens contrastantes e superiores de arroz para a tolerância a estresses abióticos (como seca, frio, ferro, salinidade e alumínio) e com manutenção de boas características agronômicas. Obter duas linhagens superiores de arroz, trigo e aveia para ensaios de valor de cultivo e uso ou similar.

Metas
- Avanço de geração e avaliação fenotípica e genotípica de linhagens de arroz, trigo e aveia. (processo contínuo ao longo dos 3 anos do projeto)- Cada ano é considerado uma sub-meta.
- Estabelecimento de uma eficiente ferramenta molecular de auxílio para seleção assistida para caracteres de importância agronômica até o final do projeto.
- Gerar conhecimento básico nos estudos de vias de resposta à estresses abióticos
- Redação de relatórios e publicações até o final do projeto.