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Estudos experimentais são necessários para avaliar e desenvolver novos biomateriais que podem aproveitar ou refutar as propriedades biológicas, farmacológicas e regenerativas do CBD com finalidade médico-odontológica. Esta é uma temática em alta internacionalmente (KOLEN 2020), com oportunidade temporalmente relevante para abordagem em pesquisa científica na área de odontologia. Em análise recente, observamos que a literatura odontológica apresenta poucos estudos sobre a temática (Tabela 1) e há prospecção internacional de patentes com a utilização de CBD para aplicações odontológicas (Tabela 2). Os dados são apresentados em inglês pois fazem parte de um artigo que está em finalização de sua redação. A despeito da temática já estar sendo investigada, ainda há muito espaço para pesquisa com CBD, especialmente veículos/biomateriais em um sistema de liberação controlada do composto e seu efeito no tecido ósseo. As patentes, todas dos EUA ou da China, envolvem diversos tipos de produtos e variadas reinvindicações, que vão de dentifrícios a produtos para clareamento, aplicações antimicrobianas e antivirais, incluindo uma patente requerendo aplicação como biomaterial para neoformação óssea.

Em estudo que publicamos recentemente (GRAZIOLI et al. 2021), sintetizamos e caracterizamos novos hidrogéis para aplicação biomédica à base de álcool polivinílico (PVA) e sulfato de condroitina (SC) contendo partículas de hidroxiapatita dopada ou não com Sr por um método de congelamento/degelo. Além de caracterizações físico-químicas do biomaterial, o ensaio de viabilidade celular sugeriu efeito bioativo e atividade promissora como material biomédico. A etapa seguinte seria testar o biomaterial e seu potencial de regeneração óssea in vivo, utilizando experimentação animal, porém o fechamento dos laboratórios com a pandemia impediu a realização desses experimentos. No presente projeto, já considerando a reabertura de laboratórios de pesquisa na UFPel, a proposta é sintetizar um hidrogel similar àquele que foi modificado por partículas de HA, agora contendo CBD, e inicialmente caracterizar este novo biomaterial in vitro. O desafio inicial é que, ao invés de partículas inorgânicas, este novo biomaterial conterá um óleo (apolar), o que suscita modificações na síntese do produto. Posteriormente, prospecta-se a realização de experimentos in vivo em modelo animal para avaliar o potencial efeito do biomaterial no reparo ósseo com ênfase no efeito da presença do CBD.

Delineamento experimental
Este estudo tem delineamento experimental a ser realizado a partir da síntese previamente desenvolvida do hidrogel de PVA/SC como scaffolds para a liberação do CBD, conforme descrições prévias (DA SILVA et al. 2017; GRAZIOLI et al. 2021). A variável independente será a presença do CBD no hidrogel sintetizado, tendo como controles o hidrogel sem CBD e, quando aplicável, um material comercial de referência (Bio-Oss Collagen, Geistlich Pharma do Brasil). As variáveis-resposta incluirão: liberação de CBD pelo biomaterial, morfologia e composição elementar do hidrogel, identificação de fases cristalinas, porosidade total, distribuição de poros abertos e fechados, capacidade de retenção de líquido, biodegradabilidade, carga de compressão, viabilidade celular e capacidade indutora e diferenciação osteogênica. Para as caracterizações in vitro dos materiais experimentais, cálculos serão realizados para definir o tamanho amostral com base em estudos-piloto (n amostral mínimo = 3). Para a análise in vivo, o cálculo amostral é apresentado. A análise in vivo será precedida de aprovação do protocolo do estudo pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da UFPel (CEEA-UFPel), que deve ser realizada com maior proximidade ao desenvolvimento desta etapa experimental.

Síntese do hidrogel controle
Já temos experiência prévia na síntese do hidrogeis de PVA/SC (DA SILVA et al. 2017; GRAZIOLI et al. 2021). De forma geral, será formulado hidrogel experimental reticulado à base de PVA (massa molar 85-124 kg/mol, 99% hidrolisado, Sigma-Aldrich, EUA) e SC (30% m/v, Sigma-Aldrich). O hidrogel será modificado ou não com partículas contendo CBD encapsulado (Epifractán, 5% CBD e menos de 0,1% THC, Medic Plast S.A, Uruguai). Este projeto envolve parceria com a Universidad de La República, Uruguai, país em que diversos compostos contendo CBD estão disponíveis comercialmente e já há expertise no manuseio e purificação do CBD. Além disso, dentro da UFPel, o projeto conta com parceria do Laboratório de Tecnologia e Desenvolvimento de Compósitos e Materiais Poliméricos (LaCoPol), que possui expertise em rotas sintéticas e foi colaborador na publicação anterior no âmbito deste projeto (GRAZIOLI et al. 2021).
O hidrogel será preparado a partir da mistura de duas soluções poliméricas (PVA e SC) utilizando a técnica de congelamento/descongelamento. A primeira, uma solução de PVA (15% m/v), será preparada a partir da solubilização de 1,5 g de PVA em 10 mL de água destilada, sendo a solução mantida sob agitação magnética a 75°C por 24 h. A segunda solução preparada será a de SC (30% m/v), para esta 3 g do biopolímero serão solubilizadas em 10 mL de água destilada, e a mistura mantida a temperatura ambiente sob agitação magnética por 24 h. Posteriormente, as duas soluções serão misturadas sob agitação magnética moderada a temperatura ambiente. A solução resultante será mantida sob agitação por aproximadamente 60 min até a obtenção de uma mistura homogênea. A solução PVA/SC será então levada ao freezer (-20°C) com o objetivo de iniciar o processo de reticulação do material. Serão realizados 5 ciclos de congelamento/descongelamento com 24 h cada (16 h congelado, 8 h descongelado). Ao final, o material será imerso em uma solução de KCL por 30 min e em água destilada por mais 30 min. Por fim, será levado a estufa a 37°C para secagem. Este processo é similar ao que realizamos em estudo recente (GRAZIOLI et al. 2021), podendo haver ajustes para aprimoramento da estrutura 3D quanto ao tamanho e distribuição de poros.

Síntese do hidrogel com CBD encapsulado
O óleo de CBD 5% será analisado em cromatógrafo gasoso acoplado ao espectrofotômetro de massas (GC-MS, QP2010, Shimadzu Ultra, Japão). Uma coluna capilar (30 m × 0,32 mm × 0,25 µm) revestida com 100% dimetil polissiloxano (Restek Corporation, EUA) será usada. Uma alíquota da amostra será diluída em hexano (1:10) e 10 µL serão injetados a 200°C no modo split. A temperatura do forno será configurada para 60°C por 5 min e aumentada para 180°C. As emulsões serão preparadas em uma solução do CBD em água (outras soluções surfactantes serão testadas), as concentrações do composto a serem inicialmente testadas serão 5%, 10%, 20%, 30% e 50% (m/m). O CBD será adicionado lentamente, nas concentrações pré-determinadas, sobre agitação de 1200 rpm por 10 min (Isotemp, Fisher Scientific, EUA). A solução será sonicada em ultrassom (VC 505, Sonics & Materials, Inc., EUA) a 20 kHz em ultrassom de sonda por 4 min para formar a emulsão.

Análises físico-químicas

Liberação de CBD, Ensaio in vitro de liberação em fluido simulado, Microscopia eletrônica de varredura e análise de energia dispersiva de raios-X, Difração de raios-X, Porosidade total, Microtomografia computadorizada, Absorção e retenção de líquidos, Biodegradabilidade in vitro, Ensaio de compressão

Caracterização biológica in vitro do hidrogel com CBD encapsulado
Para avaliar o comportamento celular do hidrogel modificado, serão analisadas adesão, viabilidade e proliferação celulares, assim como a diferenciação óssea de células-tronco. Para isso, será utilizada uma linhagem comercial imortalizada de células-tronco da polpa dental. Espécimes de aproximadamente 10 mm de diâmetro e 2 mm de comprimento serão utilizados. Células-tronco da polpa dental serão oriundas do dente decíduo procedente de um(a) doador(a) esfoliado naturalmente. As células serão obtidas após assinatura de termo de consentimento por responsável. As células serão cultivadas no meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM – Cultilab®) suplementados com soro fetal bovino (SFB – Cultilab®) a 10%. Uma garrafa (75 cm3) de cultivo celular contendo as células será transferida para a incubadora controlada com temperatura de 37ºC, 95% de umidade e 5% de CO2. Posteriormente, quando a subconfluência for atingida (80%), as células serão lavadas com PBS para remover os metabólitos. Após, serão utilizados 5 mL de tripsina/ácido etilenodiamino tetra-acético por 5 min para que ocorra a desagregação celular. Para inativação da tripsina, será utilizada a mesma quantidade de uma solução de DMEM + SFB 10%. A suspensão com as células será depositada em tubos cônicos de 15 mL e centrifugada por 5 min a 1000 rpm, resultando em uma força G de 180. Desta forma, a precipitação das células no fundo do tubo será realizada. O sobrenadante será removido, restando apenas o pellet celular. As células serão ressuspendidas em 3 mL de DMEM + SFB 10 % e 20 µL serão removidos para contagem em câmara de Neubauer. Após a contagem, serão semeadas 5×104 células (800 µL de DMEM com respectiva suplementação) por poço em uma placa de 48 poços.

Viabilidade celular
A viabilidade e proliferação celulares serão avaliadas pelo protocolo de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio). As avaliações serão realizadas em dois tempos diferentes de cultivo: 24 e 48 h. E resumo, as células-tronco serão cultivadas em placa de 96 poços (ao menos n=10 por grupo) sendo suplementadas com DMEM + SFB 10% (200 µL). A placa será incubada em condições controladas (37°C e 5% de CO2) por 24 h para que ocorra a adesão celular. Os corpos de prova de hidrogel serão confeccionados com dimensão de 5 mm × 1 mm e esterilizados por 1 h com radiação ultravioleta. Após, serão imersos em eppendorfs contendo 1 mL de DMEM/SFB 10% e mantidos por 24 h a temperatura de 37°C para realização dos eludatos. Em seguida, 200 µL dos eludatos serão depositados sobre as células e mantidos por 24 h e 48 h. Após o período, 0,5 mg de MTT será diluído em PBS, então serão depositados 200 µL da solução em cada poço. A placa será mantida por mais 4 h em condições controladas. Após o período, o meio será aspirado e os cristais formados serão suspendidos em 200 µL de dimetil sulfóxido (DMSO) 10%. O DMSO permanecerá em contato com as células por 15 min e em seguida a placa será colocada por mais 5 min em um agitador (150 rpm). Os resultados serão avaliados por meio de espectrofotometria no Leitor Universal de ELISA, em comprimento de onda de 540 nm, em que serão considerados os valores de absorbância como indicador da viabilidade celular.
Para avaliar a adesão celular, serão utilizados marcadores indicadores de vinculina e observados por imuno-histoquímica. Após três dias de contato das células com os hidrogéis, os grupos serão imersos em formol para fixação. Os espécimes serão estendidos em lâminas de vidro em que os cortes inicialmente serão desparafinizados e reidratados. A análise descritiva do padrão de marcação imuno-histoquímica, identificação e a distribuição dos antígenos será realizada por microscopia óptica. Os achados serão anotados individualmente e estabelecido o padrão de marcação para o antígeno pesquisado, bem como a sua localização. Posteriormente serão observados em microscópio confocal para avaliar as células que ficarão aderidas no hidrogel ou CBD. As células-tronco serão usadas conforme descrito no subtítulo anterior, sendo isoladas em meio Eagle modificado alfa suplementado com soro fetal bovino a 10%, 20 µg / mL de ácido ascórbico e fator de crescimento básico de fibroblasto de 5 ng / mL para culturas comuns. O meio será trocado a cada 2 dias até alcançar uma confluência de 80%. Serão coletadas com tripsina a 0,25%, colhidas em uma concentração de 0,5 × 104 cm2 em 0,5 mL. Posteriormente, serão incubadas com anticorpos monoclonáveis e levados a um citômetro de fluxo (Auttune©) para caracterização das células-tronco positivas para anticorpos CD73, CD90, CD105, CD166, CD44 e CD29, e negativa a anticorpos de superfície CD14, CD19, CD34, CD45. Procedimentos similares foram descritos em nossa publicação anterior (GRAZIOLI et al. 2021).

Análise dos dados
Os dados serão analisados qualitativa e quantitativamente.

Os resultados antecipados da presente proposta estão relacionados ao domínio da técnica de manipulação, síntese e/ou modificação de hidrogéis biodegradáveis, ecologicamente amigáveis e biocompatíveis, potencialmente aplicáveis em processos de regeneração/reparo ósseo para a área da saúde. Antecipa-se que os biomateriais sintetizados neste estudo contendo CBD poderão ser capazes de estimular a regeneração óssea em padrões superiores ao biomaterial controle. Ainda, antecipa-se o entendimento de como a presença de CBD, pela primeira vez sendo testado neste modelo de biomaterial, pode modular o processo de regeneração de novo osso, elucidando a potencial aplicabilidade deste composto em aplicações biomédicas de reparo ósseo. O CBD é um composto altamente promissor no mercado e na ciência mundial contemporânea, dando alta visibilidade potencial ao projeto em termos de veiculação nos principais periódicos da área assim como repercussão em mídia convencional. Por fim, os diferentes processos e técnicas envolvidos no estudo poderão ocasionar o desenvolvimento de novas metodologias de síntese de biomateriais, além de potencialmente darem origem a um produto que possa ser discutida sua viabilização comercial, ampliando a inserção potencial da proposta na sociedade em longo prazo.

Meta Física 1: Definição de protocolos para síntese de micro ou nanopartículas contendo CBD para posterior incorporação aos hidrogéis, incluindo aquisição de reagentes.
Indicador: Obtenção das partículas prontas para uso.

Meta Física 2: Definição de protocolos de síntese laboratorial de hidrogéis modificados por CBD e do hidrogel controle (sem CBD).
Indicador: Obtenção de scaffolds com porosidade e características morfológicas adequadas contendo CBD ou não.

Meta Física 3: Caracterização in vitro dos hidrogéis obtidos na meta física 2.
Indicador: Registro de dados in vitro de características físico-químicas das estruturas obtidas na meta física 2, incluindo capacidade de liberação do CBD, conforme metodologia proposta.

Meta Física 4: Definição de grupos e testes celulares dos hidrogéis experimentais sintetizados contendo ou não CBD a partir da meta física 3, conforme metodologia proposta.
Indicador: Registro de dados de atividade celular frente aos biomateriais obtidos na meta física 2.

Meta Física 5: Definição de grupos e testes biológicos em modelo animal dos hidrogéis conforme metodologia proposta.
Indicador: Registro de dados in vivo do comportamento dos biomateriais, incluindo prévia análise do projeto por comitê de ética em experimentação animal.

Meta Física 6: Monitoramento da evolução do projeto por meio de gestão e apoio técnico, incluindo tese de doutorado a ser desenvolvida como parte deste estudo.
Indicador: Finalização dos experimentos, registro de dados laboratoriais, análise dos dados, realização de novos experimentos (caso necessário) e defesa da tese de doutorado.

Meta Física 7: Publicação de ao menos dois artigos científicos em periódicos internacionais com boa visibilidade e indicadores bibliométricos na área de biomateriais e engenharia biomédica.
Indicador: Submissão dos artigos científicos e publicação em periódicos especializados.

Meta Física 8: Apresentação de resultados parciais e finais do projeto em pelo menos um evento científico nacional e um internacional.
Indicador: Trabalhos apresentados em eventos de relevância para a área odontológica (SBPqO, GBMD, IADR e/ou ADM).

Meta Física 9: Finalização do relatório e prestação de contas do projeto.
Indicador: Entrega de relatório científico e documentos da prestação de contas, conforme normas de agências que porventura fomentarem o estudo.

Meta Física 10: Prospecção de novos estudos a partir dos dados obtidos e potencial produto a partir das estruturas aqui desenvolvidas.
Indicador: Novos projetos submetidos a agências de fomento, novos estudos, dissertações e/ou teses realizadas na mesma linha de pesquisa, e contato com empresas de biomateriais de forma a permitir desenvolvimento conjunto de material que possa ser útil na regeneração óssea para a área da saúde.