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Com isso, esta proposta tem como objetivo avaliar o envolvimento dos sistemas colinérgico e monoaminérgico no efeito do 4-PSQ em modelos de doença de Alzheimer/déficit cognitivo e suas comorbidades, utilizando modelos com roedores. Além disso, almeja-se prospectar um candidato a fármaco como uma estratégia terapêutica para a doença de Alzheimer e comorbidades, buscando melhorar a qualidade de vida de seus portadores. Os resultados obtidos pelo LaFarBio reforçam o potencial da presente proposta para alavancar o entendimento na fronteira do conhecimento dos mecanismos envolvidos na doença de Alzheimer e nas comorbidades.
Esta proposta é motivada pelos seguintes fatores: i) aumento do envelhecimento populacional e da expectativa de vida; ii) aumento das comorbidades na doença de Alzheimer; iii) ausência de alternativa terapêutica que promova a neuroplasticidade e neurogênese cerebral; iv) redução na qualidade de vida do paciente acometido com comorbidade e doença de Alzheimer que realizam os tratamentos disponíveis no mercado; v) etiologia multifatorial da doença; vi) efeitos adversos da utilização de medicamentos combinados; e vii) a necessidade da busca de moléculas multifuncionais com duas ou mais atividades biológicas complementares.
Por meio dos resultados obtidos se espera identificar fatores de risco e novos alvos terapêuticos para o tratamento da doença de Alzheimer e comorbidades, primando pela inovação científica e tecnológica para atender as demandas da sociedade. Almeja-se desenvolver uma nova estratégia farmacológica, capaz de melhorar a qualidade de vida dos pacientes com doença de Alzheimer, em especial dos pacientes idosos. No desenvolvimento desta proposta serão envolvidos alunos de iniciação científica e pós-graduação, gerando trabalhos de conclusão de curso, dissertações e teses relacionadas com o tema. Assim, esta proposta visa contribuir para a consolidação e fortalecimento das linhas de pesquisa do LaFarBio, vinculado ao Grupo de Pesquisa em Neurobiotecnologia (GPN) e ao PPGBBio da UFPel. Pretende-se também realizar o depósito de patentes e publicar os resultados obtidos em periódicos científicos de abrangência internacional, a fim de contribuir com a inovação científica e tecnológica.

O presente projeto utilizará técnicas de domínio do grupo executor, sendo sua grande maioria de fácil treinamento e aprendizagem. Os experimentos apresentados nesta proposta serão realizados no LaFarBio da UFPel. Ainda, se necessário, alguns experimentos poderão ser desenvolvidos em outros laboratórios de pesquisa da UFPel ou de outras instituições de ensino e/ou pesquisa, através de colaborações científicas já estabelecidas pela proponente, bem como através de novas colaborações que possam ser efetivadas com o desenvolvimento deste projeto. A seguir está apresentada de maneira resumida a metodologia a ser empregada:
Síntese do 4-PSQ
O 4-PSQ (Figura 1) será sintetizado no Laboratório de Síntese Orgânica Limpa (LASOL) da UFPel conforme metodologia previamente publicada (DUARTE et al., 2017).
Animais e Aspéctos Éticos
Para a realização da metodologia proposta neste projeto, serão utilizados camundongos machos e fêmeas Swiss (03 meses e 22 meses) obtidos do Biotério Central da UFPel. Os animais serão mantidos em um ambiente com temperatura e ciclo claro-escuro controlados, recebendo água e ração ad libittum. Serão aplicados critérios rigorosos de ética para minimizar a dor e o sofrimento dos animais. Todos os experimentos descritos nesta proposta serão conduzidos de acordo com as normas do Comitê de Ética e Bem-Estar Animal da UFPel e este projeto encontra-se aprovado sob o nº CEEA 28008-2019. Além disso, todos os experimentos estarão de acordo com o guia do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal.

Investigação da ligação 4-PSQ em enzimas dos sistemas monoaminérgico e colinérgico através de estudos de docagem molecular, in silico
Para entender o modo de ligação do 4-PSQ com as enzimas do sistema colinérgico (AChE e BuChE) e com as enzimas do sistema monoaminérgico (MAO-A e MAO-B) será utilizada a ferramenta de docagem molecular.

Determinação do efeito do 4-PSQ em enzimas dos sistemas monoaminérgico e colinérgico de estruturas cerebrais de camundongos, in vitro
Um aumento na atividade das enzimas MAO-A, MAO-B, AChE e BuChE tem sido relatado no déficit cognitivo/doença de Alzheimer. Dessa forma, uma estratégia de ação deste estudo é determinar se o 4-PSQ tem efeito inibitório na atividade destas enzimas, a fim de identificar os mecasnimos da ação farmacológica do composto. Para avaliar as propriedades inibitórias do 4-PSQ na atividade das enzimas MAO-A e MAO-B, o composto em diferentes concentrações será incubado juntamente com os homogenatos de córtices cerebrais ou hipocampos de camundongos. A fim de verificar o efeito do 4-PSQ na atividade da AChE e BuChE, o composto, em diferentes concentrações, será incubado juntamente com os homogenatos de córtices cerebrais ou hipocampos de camundongos.

Determinação da ação do 4-PSQ no tratamento das alterações comportamentais em um modelo de doença de Alzheimer em camundongos
O modelo de injeção intracerebroventricular do peptídeo βA é amplamente aceito para o estudo da patofisiologia da doença de Alzheimer, bem como para o screening de agentes anti-doença de Alzheimer. A utilização deste modelo tem como estratégia de ação determinar se o 4-PSQ apresentará efeito no tratamento das alterações comportamentais em um modelo de doença de Alzheimer, como uma forma de encontrar uma alternativa terapêutica para esta doença e suas comorbidades.
Trinta minutos após cada tratamento, os animais serão submetidos aos testes comportamentais: teste do nado forçado, teste da suspensão da cauda, campo aberto, borrifagem de sacarose, tarefa do reconhecimento do objeto, tarefa da esquiva inibitória e teste de preferência da sacarose. Imediatamente após os testes comportamentais, os animais serão submetidos a eutanásia e os córtices cerebrais e hipocampos serão removidos para os experimentos ex vivo: níveis de acetilcolina; atividades das enzimas AChE, BuChE, ChAT, MAO-A e MAO-B, parâmetros de estresse oxidativo, níveis de BDNF e NGF, níveis de Nrf2 e s Keap1, e níveis de GSK-3β e CREB.

Avaliação do efeito do tratamento com o 4-PSQ no déficit cognitivo e suas comorbidades em camundongos envelhecidos
O estudo do envelhecimento por si só em roedores representa um modelo valioso para se entender a cinética do processo de neurodegeneração e a progressão gradativa de comprometimentos cognitivos e/ou emocionais, os quais, em uma sequência contínua de eventos, podem acometer os indivíduos em fases mais tardias da vida. Dessa forma, a utilização de roedores envelhecidos tem como estratégia de ação determinar se o tratamento com o 4-PSQ apresentará efeito no déficit cognitivo e comorbidades, como uma alternativa de encontrar um novo tratamento para estas condições em idosos. Após 30 dias de tratamento, os animais serão submetidos aos testes comportamentais: campo aberto, tarefa do reconhecimento do objeto, teste do nado forçado, e tarefa da esquiva inibitória. Ao final dos testes comportamentais, os animais serão submetidos a eutanásia e os córtices cerebrais e hipocampos serão removidos para os experimentos ex vivo: níveis de acetilcolina; atividades das enzimas AChE, BuChE, ChAT, MAO-A e MAO-B, parâmetros de estresse oxidativo, níveis de BDNF e NGF, níveis de Nrf2 e Keap1, e níveis de GSK-3β e CREB.

Determinação da ação anti-amnésica do 4-PSQ e avaliação do efeito do composto em mitigar o déficit cognitivo e as comorbidades em um modelo de amnésia em camundongos
A disfunção colinérgica é um dos fatores responsáveis pela amnésia na patofisiologia da doença de Alzheimer (KUMAR et al. 2015). Será utilizado um modelo de amnésia induzida pela injeção de brometo de escopolamina como estratégia de ação para investigar o efeito anti-amnésico do 4-PSQ, bem como a ação do composto na comorbidade depressão e déficit cognitivo. A escopolamina causa amnésia pois é um antagonista colinérgico não seletivo dos receptores muscarínicos (da SILVA et al., 2017; KIM et al., 2018). Ao final do protocolo experimental, os animais serão submetidos aos testes comportamentais: teste do nado forçado, teste da suspensão da cauda, borrifagem de sacarose, campo aberto, tarefa do reconhecimento do objeto, e tarefa da esquiva inibitória. Ao final do protocolo experimental, os animais serão submetidos a eutanásia e os córtices cerebrais e hipocampos serão removidos para os experimentos ex vivo: níveis de acetilcolina; atividades das enzimas AChE, BuChE, ChAT, MAO-A e MAO-B, parâmetros de estresse oxidativo, níveis de BDNF e NGF, níveis de Nrf2 e s Keap1, e níveis de GSK-3β e CREB.

Investigação da toxicidade hepática e renal do 4-PSQ nos diferentes protocolos experimentais em roedores
Ao final de todos os protocolos experimentais, os animais serão anestesiados e o sangue será coletado por punção cardíaca para a determinação de marcadores de toxicidade hepática (aspartato amino transferase (AST) e da alanina amino transferase (ALT)) e renal (ureia e creatinina), através de kits comerciais. Além disso, será determinada a atividade da MAO-B no fígado como marcador de toxicidade periférica do composto. A análise destes parâmetros tem como estratégia de ação determinar a toxicidade do 4-PSQ nos diferentes protocolos experimentais.

Análise estatística
Os dados dos experimentos serão expressos como média ± erro padrão da média. Os testes de normalidade e homogeneidade serão realizados para confirmar o status paramétrico dos resultados. Logo, as análises estatísticas serão realizadas utilizando test t de Student ou análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelo teste de Newman-Keuls, quando apropriado. As diferenças entre os grupos serão consideradas significativas quando p < 0,05.

Tendo em vista a metodologia utilizada espera-se elucidar o envolvimento dos sistemas colinérgico e monoaminérgico, assim como do estresse oxidativo e de moléculas de sinalização celular na doença de Alzheimer e suas comorbidades. Ainda, pretende-se identificar uma nova alternativa terapêutica para o tratamento da doença de Alzheimer e comorbidades, primando pela inovação científica e tecnológica para atender as demandas da sociedade. Também, pretende-se entender os mecanismos de ação do 4-PSQ na melhora dos sintomas relacionados com a doença de Alzheimer e comorbidades associadas. Com o desenvolvimento desta proposta almeja-se envolver alunos de iniciação científica e pós-graduação, gerando trabalhos de conclusão de curso, dissertações e teses relacionadas com o tema. Pretende-se também realizar o depósito de patentes e publicar os resultados obtidos em periódicos científicos de abrangência internacional.
A presente proposta tem como prospecção continuar aumentando a qualidade dos artigos publicados, contribuir para a formação de recursos humanos de qualidade, desenvolver uma nova estratégia terapêutica e consolidar as parcerias estabelecidas com pesquisadores nacionais e internacionais, bem como com a indústria farmacêutica. Ainda, espera-se que a pesquisa realizada contribua para melhorar a qualidade de vida dos pacientes com doença de Alzheimer e motive jovens cientistas a continuarem preocupando-se com questões científicas e sociais.