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Na atualidade, há uma clara relação entre hábitos alimentares não saudáveis e a progressão de diversas doenças fisiológicas, incluindo disfunções imunológicas, cancerígenas, por estresse oxidativo e o envelhecimento precoce (Chandra et al., 2020). A suplementação com carotenóides à dieta fornece benefícios a saúde do organismo que a consume, como por exemplo a ação protetora relatada pela ingestão de vegetais ricos em carotenóides contra o risco do desenvolvimento de câncer. O possível potencial anticarcinogênico deste composto sugere que a suplementação alimentar pode ser uma alternativa de quimioprevenção (Steinmetz e Potter, 1991; Gloria et al., 2014; Holick et al., 2002), também funcionando como anti-inflamatório (Kajiura et al., 2018) e antioxidante (Fiedor e Burda, 2014, Stahl e Sies, 2003).
Dentre os carotenóides, aproximadamente 40 tipos possuem atividade pró-vitamina A (Ollilainen, et al., 1988), como por exemplo o alfa e o beta-caroteno, onde este último possui maior quantidade de pró-vitamina A em relação aos demais (Damodaram, et al., 2010). O beta-caroteno é um pigmento natural de coloração amarelo-alaranjada com diversos efeitos benéficos no metabolismo dos organismos vivos. Este carotenóide é o principal precursor da vitamina A e apresenta propriedades antioxidantes, fornecendo proteção contra vários fatores de estresse como a radiação ultravioleta, espécies reativas de oxigênio e radicais livres (Li, et al., 2020). O beta-caroteno também atua na regulação de genes, no sistema imunológico e na camuflagem, comunicação, interação e especiação de alguns vertebrados, sendo um aditivo nutricional essencial na dieta de tais animais (Sefc, et al., 2014).
O beta-caroteno apresenta outras funções biológicas de suma importância no crescimento e saúde dos organismos aquáticos, como peixes da Família Salmonidae, incluindo o salmão e a truta, bem como crustáceos da Ordem Decapoda, compreendendo o camarão e a lagosta (Carvalho e Caramujo, 2017). Estudos prévios já demonstraram que uma dieta rica em carotenóides aumenta drasticamente a taxa de sobrevivência dos ovos e estágios iniciais das larvas dos peixes, favorecendo assim, sua reprodução (Torrissen e Christiansen, 1995; Fukunishi et al.,2012). Além disso, a pigmentação diferenciada dos animais aquáticos propiciada pela ingestão de beta-caroteno é um dos atributos de qualidade relevante para aceitação do consumidor e valor de mercado, sem contar com o seu enriquecimento nutricional (Carvalho e Caramujo, 2017). Na aquicultura, carotenóides são considerados como requisitos nutricionais importantes na formulação das rações (Bjerkeng 2008 ; NRC, 2011), uma vez que influencia diretamente na coloração da carne do organismo produzido, logo, também no seu valor de mercado (Zeng, et al., 2010; Baron, et al., 2008). Estes organismos aquáticos são incapazes de sintetizar carotenóides, como por exemplo o β-caroteno, o maior responsável pela coloração destes animais, desta forma sendo necessária a suplementação nas dietas (Kelestemur e Çoban, 2016).
Dentre os diversos benefícios da suplementação de beta-caroteno, a atividade pró-vitamina A e a atividade antioxidante se destacam neste grupo de carotenóides. Antioxidantes podem ser definidos como substâncias que inibem a ação de espécies reativas de oxigênio (EROs) e reações de complexação de metais, uma vez que retardam a velocidade de oxidação (Pietta, 2000). O sistema de defesa antioxidante é responsável por equilibrar a formação e consumo de radicais livres no corpo, no entanto quando comprometida esta capacidade antioxidante, há o acúmulo destes EROs, podendo resultar em um estresse oxidativo (Song e Yen, 2002), a aceleração do processo de envelhecimento (Birch-Machin e Bowman, 2016) e o desenvolvimento de diversas doenças degenerativas (Valentão et al., 2002).
Nesse contexto, a busca por alternativas saudáveis, tanto para seres humanos quanto para a aquicultura, seja no tratamento de doenças ou melhoria da qualidade do pescado, levaram ao aumento de estudo abordando novas estratégias a fim de produzir moléculas bioativas para tratamento e prevenção de estresse (Chandra et al., 2020). Desta forma há o interesse de avaliar o potencial antioxidante do beta-caroteno produzido na levedura Yarrowia lipolytica em peixes.

CEUA

Todos os ensaios experimentais serão realizados seguindo o projeto aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de Pelotas nº CEUA 019719/2023-77.

PRODUÇÃO DO BETA-CAROTENO
A levedura Yarrowia lipolytica geneticamente manipulada será gentilmente cedida pelo Prof. Rodrigo Almeida da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Os cultivos da levedura será feito conforme descrito em Souza et al., 2020. Os sobrenadantes dos cultivos serão submetidos a análise por HPLC (Shimadzu) para detecção e quantificação de 3-HP, utilizando injeção automática e detecção por índice de refração. A coluna utilizada será a Aminex® HPX-87H (Bio-Rad), com 300 mn X 7,8 mn. A fase móvel utilizada será uma solução 6 mM de ácido sulfúrico da marca Tedia em água padrão MiliQ filtrada em membrana de 0,22 µm. Os sobrenadantes dos cultivos serão submetidos a injeção de um volume de 20 µL para separação em uma temperatura da coluna de 65°C em um fluxo de 0,6 mL/min em corridas de 20–25 minutos de duração, conforme BRÊDA (2019).
O beta-caroteno extraído será analisado em HPLC equipado com o Detector de Arranjo Diodos (DAD) (Shimadzu) e coluna C-18 Nova-Pak 60Å, 4μm e 3,9 x 150 mm (Waters). As análises serão realizadas a 455 nm e no modo isocrático, com a fase móvel consistindo de acetonitrila 70% e acetato de etila 30% (v/v), em fluxo constante de 0,5 mL.min-1. A temperatura do forno será mantida a 30 ºC e o volume de injeção será fixado em 10 μL (SOUZA et al. 2020). O beta-caroteno será produzido e purificado no LaMMP – UFRJ.

ALIMENTAÇÃO COM DIETA SUPLEMENTADA
Serão formuladas quatro dietas isoproteicas e isoenergéticas visando a atender as exigências da zebrafish. As rações serão produzidas pelo Laboratório de Nutrição de Peixes do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), sob coordenação da pesquisadora Ligia Uribe. Serão utilizadas uma dieta controle (CO), sem adição de levedura, e três dietas com ingredientes teste: levedura sem beta-caroteno (LSB), levedura com beta-caroteno com 50mg.kg-1 (LCB50) e levedura com beta-caroteno 100mg.kg-1 (LCB100). As concentrações de beta-caroteno foram escolhidas com base nos estudos de Amar et al, 2001 e Keleştemur and Çoban, 2016.

Serão utilizados 20 animais para cada grupo experimental (CO, LSB, LCB50 e LCB100) com triplicata (60 animais por grupo, totalizando 240 animais).Todos os grupos experimentais serão mantidos em aquários de 30L com aeração constate e com todos os parâmetros de qualidade de água monitorados e adequados para a espécie.

Os peixes serão distribuídos em um delineamento inteiramente casualizado, com quatro tratamentos, contendo diferentes formulações com beta-caroteno (CO, LSB, LCB50 e LCB100). Os peixes serão alimentados duas vezes ao dia com ração (5% do peso/peixe) por 8 semanas. Para isso, os peixes serão anestesiados com tricaína (200m g/L) e submetidos a análise de parâmetros biométricos (peso e tamanho). Ajustes de quantidade de ração ofertada em relação ao pesos dos animais serão feitos, por biometria seguindo protocolo de anestesia e cuidado no manejo animal, a cada 2 semanas. Após as 8 semanas de alimentação os peixes, de cada grupo experimental, serão separados aleatoriamente em dois grupos de 10. Assim, 10 animais serão eutanasiados (tricaína 600mg/L) e dissecados para posterios análises de expressão de genes e 10 peixes também serão eutanasiados (tricaína 600mg/L), dissecados e serão realizadas as análises bioquímicas de parâmetros oxidativos e antioxidativos.

Análise de expressão de genes

Para a análise de expressão de genes, serão usados 10 animais por grupo experimental. Após a eutanásia os mesmos serão dissecados e os tecidos serão colocadas em tubos eppendorf e armazenadas a -80 °C.
Após a coleta as análises de expressão de genes será feita no Laboratório de Biologia Molecular da FURG. Será feita a análise de expressão gênica por reação de reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR). Para tanto, serão selecionados, pelo menos, três genes de referência, os quais serão utilizados como normalizadores nas reações. Os primers serão desenhados de acordo com as sequências disponíveis do GeneBank para os principais genes que codificam para proteínas antioxidantes e estresse celular. A análise de RT-qPCR será, primeiramente, feita pela extração de RNA total, utilizando o reagente Trizol. Será feito o tratamento com DNAse I para a eliminação dos contaminantes de DNA. A integridade do RNA será avaliada em gel de agarose e em espectofotômetro Nanodrop 1000 (Thermo Scientific) e quantificadas em kit de fluorometria (Qubit). Para a síntese de cDNA será utilizado o kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), seguindo todas as instruções do fabricante. Para a amplificação e quantificação dos transcritos será utilizado o kit SYBR Greeen PCR Master Mix (Applied Biosystems) seguindo as instruções do fabricante.

Análise dos parâmetros bioquímicos
Todos os ensaios enzimáticos serão realizados a 25 °C, e as análises seguirão protocolos pré-estabelecidos na literatura. A atividade de catalase (CAT) será determinada como descrito por Beutler (1975), o superóxido dismutase total (SOD) será quantificada de acordo com McCord e Fridovich (1969). A concentração de EROs utilizando metodologia in vivo (Mugoni et al., 2014, a concentração de glutationa (GSH) (Massarsky et al., 2016) e Peroxidação Lipídica (LPO) (Oakes & Van der Kraak, 2003). Os ensaios bioquímicos serão realizados no Laboratório de Bioquímica Experimental da FURG

Indicadores
- Produção de ração para peixes suplementadas com beta-caroteno recombinante com potencial antioxidante;
- Determinação do espectro de atividade antioxidante do bioproduto beta-caroteno;
- Publicação de artigos científicos em revistas indexadas especializadas (Qualis A e B) e de divulgação científica;
- Fortalecimento das colaborações entre o Laboratório de Biologia Molecular (FURG, Brasil), Laboratório de Microbiologia Molecular e Proteínas (LaMMP-UFRJ, Brasil) e o Programa de Pós-Graduação Multicêntrico em Ciências Fisiológicas (UFPEL).

O principal resultado será o estabelecimento do potencial antioxidante do pigmento beta-caroteno recombinante. A partir dos dados de obtidos será possível utilizar esse pigmento como aditivo alimentar capaz de aumentar a resposta antioxidante frente a diferentes estressores ambientais. O produto gerado por essa colaboração científica poderá ser utilizado pela cadeia produtiva da alimentar, tanto de nutrição animal como humana.