Nome do Projeto
Avaliação de Salmonella enterica e esporos de Bacillus subtilis como plataformas para o desenvolvimento de vacinas contra leptospirose
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
19/05/2023 - 31/12/2025
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
A leptospirose é uma doença zoonótica causada por espiroquetas do gênero Leptospira. A vacinação é a medida preventiva mais indicada contra a leptospirose. As vacinas de subunidade baseada em antígenos recombinantes tornaram-se uma alternativa atrativa, pois podem conferir proteção cruzada de maior duração e são relativamente fáceis de produzir. Várias proteínas da membrana externa de Leptospira foram avaliadas como antígenos na formulação de vacinas recombinantes, incluindo as lipoproteínas, como LipL32, LemA e as adesinas como LigA. Outra classe de proteínas que tem apresentado resultados promissores como antígenos vacinais são os receptores dependentes de TonB (TBDRs). O desenvolvimento de vacinas as quais os antígenos possam vir a ser apresentados às células imunes pela via de mucosa auxiliaria na segurança e facilidade de sua administração, além de induzir uma resposta imune sistêmica específica. Uma estratégia para a apresentação de antígenos pela via de mucosas é o uso de bactérias vivas atenuadas expressando os antígenos de interesse, como Salmonella enterica. Esporos de Bacillus subtilis tem sido avaliados como sistema de apresentação de antígenos recombinantes no desenvolvimento de vacinas. O objetivo desta proposta é desenvolver formulações vacinais utilizando Salmonella enterica sorovar Typhimurium (S. Typhimurium) e esporos de Bacillus subtilis como sistema de entrega de antígenos para o desenvolvimento de vacinas contra a leptospirose. Hamsters serão vacinados pela via oral, nasal e subcutânea com S. Typhimurium expressando quimeras compostas por LipL32, LemA, LigANI e por outras três TBDRs: LIC10896, LIC10964 e LIC12374. Assim também vacinados por estas proteínas adsorvidas na superfície de esporos de B. subtilis. Os hamsters serão desafiados com uma cepa patogênica de Leptospira interrogans. A imunidade esterilizante será determinada pelo isolamento da bactéria através da cultura do tecido renal pela detecção do DNA da bactéria através da reação em cadeia da polimerase em tempo real. A resposta imune humoral será avaliada através de ELISA indireto. A resposta imune celular será caracterizada através da quantificação da transcrição relativa de mRNA de citocinas em células mononucleares do sangue periférico. O desenvolvimento de formulações vacinais utilizando S. Typhimurium e esporos de B. subtilis como sistema de entrega destes antígenos representam uma alternativa promissora para o controle da leptospirose humana e animal.

Objetivo Geral

Desenvolver formulações vacinais utilizando Salmonella enterica sorovar Typhimurium (S. Typhimurium) e esporos de Bacillus subtilis como sistema de entrega de antígenos para o desenvolvimento de vacinas contra a leptospirose.

Justificativa

A leptospirose é uma doença zoonótica causada por espiroquetas do gênero Leptospira, que acomete humanos e animais em todo o mundo, sendo considerada um grande problema de saúde pública. Na pecuária, a leptospirose causa perdas econômicas significativas devido às altas taxas de falhas reprodutivas, como aborto, natimortos, infertilidade e redução da produção de leite. A vacinação é a medida preventiva mais indicada contra a leptospirose. Neste estudo, vamos desenvolver formulações vacinais utilizando Salmonella enterica sorovar Typhimurium (S. Typhimurium) e esporos de Bacillus subtilis como sistema de entrega de antígenos para o desenvolvimento de vacinas contra a leptospirose. A partir dos resultados obtidos esperamos realizar o depósito de pedidos de patentes e publicações de trabalhos em periódicos científicos internacionais, além de proporcionar o treinamento de estudantes de pós-graduação e a consolidação desta área de pesquisa.

Metodologia

Os animais serão imunizados pela via oral, nasal e subcutânea com S. Typhimurium expressando quimeras compostas por LipL32, LemA, LigANI e por outras três TBDRs: LIC10896, LIC10964 e LIC12374. Assim também vacinados com estas proteínas adsorvidas na superfície de esporos de B. subtilis. Amostras de sangue serão coletadas através da punção da veia de maior calibre entre os dentes incisivos inferiores nos dias 0 (pré-vacinação), 14, 28 e 42 (pós- vacinação). Antes de realizar a coleta de sangue os animais serão submetidos a leve anestesia com isoflurano. O soro será separado por centrifugação e armazenado à -20° C até a sua utilização. No dia 42 pós-primeira dose os hamsters serão desafiados com inóculo letal de L. interrogans sorovar Copenhageni cepa L1-130 (100 × ED50), L. interrogans sorovar Canicola (100 × ED50) e L. interrogans sorovar Pomona (100 × ED50), através da inoculação pela via intraperitoneal. Após o desafio, será feito um monitoramento dos animais duas a três vezes ao dia até 28 dias posteriores ao desafio. Animais com sinais clínicos de leptospirose e moribundos serão eutanasiados, conforme normas e regulamentos do Conselho Nacional de Controle de Experimentação (CONCEA). Os critérios utilizados para determinar o momento da eutanásia serão: perda de 10% do peso máximo, prostração, pelo eriçado, apatia, falta de apetite, hematúria, uveíte e hemorragia. Ao final do experimento os animais sobreviventes serão eutanasiados. A imunidade esterilizante será definida segundo o isolamento através da cultura de macerado renal, a detecção de patologias associadas à leptospirose e a identificação histológica de leptospiras nos tecidos dos animais sobreviventes. A eficácia da vacina será determinada pelo número de animais sobreviventes ao desafio, quando comparado ao grupo controle. Ao final do experimento os animais sobreviventes serão eutanasiados de acordo com as normas internacionais e em consonância com os princípios éticos de experimentação animal do CONCEA. A resposta imune humoral será avaliada por ELISA indireto e a proteção contra mortalidade e as taxas de sobrevivência serão determinadas usando teste exato de Fisher e teste de log-rank.

Indicadores, Metas e Resultados

-Obtenção de seis formulações vacinais utilizando duas plataformas vacinais imunogênicas e inovadoras;
-Formulações vacinais avaliadas em hamsters através dos testes de proteção ao desafio letal;
-Formulações vacinais avaliadas quanto ao perfil de imunoglobulinas induzidas;
-Formulações vacinais avaliadas quanto ao perfil de transcritos de mRNA das citocinas induzidas;
-Formulações vacinais avaliadas quanto a capacidade de indução de imunidade esterilizante;
-Publicação de artigos científicos em periódicos especializados;
-Obtenção de produtos protegidos por patenteamento;
-Estudos para licenciamento do produto tecnológico desenvolvido.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
ANA CAROLINA KURZ PEDRA
DOMITILA BRZOSKOWSKI CHAGAS
FRANCISCO DENIS SOUZA SANTOS
MARA ANDRADE COLARES MAIA
NATASHA RODRIGUES DE OLIVEIRA
ODIR ANTONIO DELLAGOSTIN2
PEDRO HENRIQUE FILGUEIRAS COELHO SOUZA
THAIS LARRÉ OLIVEIRA BOHN2
TIFFANY THUROW BUNDE

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