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A leptospirose foi relatada há dois séculos atrás e permanece como um importante problema de saúde pública, sendo amplamente difundida em todo o mundo (KARPAGAM; GANESH, 2020). A doença é causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira, as quais possuem características morfológicas que permitem a fácil invasão dos tecidos do hospedeiro, podendo atingir órgãos como fígado, pulmão e principalmente rins, em pouco tempo após a infecção (BHARTI et al., 2003; HAAKE; LEVETT, 2015). Contudo, ainda não está estabelecido quais fatores estão relacionados com a suscetibilidade à doença, assim como há uma falta de conhecimento sobre a resposta imune específica que confere proteção contra a infecção (FELIX et al., 2020; MATSUI et al., 2011). O hamster sírio dourado (Mesocricetus auratus) é um modelo animal bem caracterizado para estudos de leptospirose e, consequentemente, é amplamente utilizado em trabalhos que avaliam a infecção por Leptospira spp. e a eficácia de vacinas contra a doença (GOMES-SOLECKI; SANTECCHIA; WERTS, 2017; VERNEL-PAUILLAC; GOARANT, 2010). No entanto, não existem reagentes e insumos comerciais disponíveis para avaliar a resposta celular a nível proteômico nesse modelo animal. Sendo assim, a técnica de PCR quantitativo em tempo real tem sido uma alternativa para analisar o perfil transcricional de citocinas, quimiocinas e outros genes relacionados a resposta celular em hamsters (MATSUI et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2015).
As análises de expressão gênica através de RT-qPCR são precisas, no entanto elas estão sujeitas a diversas variáveis que podem afetar a confiabilidade da quantificação, como a integridade e quantidade de RNA extraído, desenho de primers e eficiência da síntese de cDNA (BUSTIN, 2002; BUSTIN et al., 2009). A abordagem mais aceita para minimizar as variações do processamento de amostras é realizar uma normalização relativa. A quantificação relativa analisa as mudanças na expressão de um gene alvo em relação à expressão de um gene de referência (BUSTIN et al., 2009; HUGGETT et al., 2005). Logo, essa análise também visa corrigir as variações relacionadas às condições experimentais, como as condições de cultura, tratamentos experimentais e diferentes tipos de células e tecidos, permitindo com que a expressão gênica nas amostras seja comparada (DERVEAUX; VANDESOMPELE; HELLEMANS, 2010; HUGGETT et al., 2005). Portanto, a escolha de um gene de referência, também chamado de controle interno ou gene endógeno, para normalizar os dados de expressão gênica é uma das etapas mais cruciais no delineamento experimental de projetos que envolvam essa técnica.
Um gene de referência ideal deve ser expresso em um nível constante nas amostras e sua expressão é assumida como não afetada pelas condições experimentais (BUSTIN, 2002). Os genes usados como controles endógenos em experimentos de RT-qPCR são frequentemente escolhidos com pouco conhecimento prévio da sua expressão nas condições experimentais examinadas, e são selecionados arbitrariamente de um conjunto de genes comumente utilizados como controles endógenos, como GAPDH e β-actina (DHEDA et al., 2004). No entanto, alguns estudos sugerem que genes de referência universais não existem, pois exibem níveis de expressão divergentes dependendo das condições avaliadas. Portanto, a utilização desses genes de referência universais pode levar a erros significativos na interpretação de dados, sendo essencial identificar e validar genes de referência específicos para cada sistema experimental (DHEDA et al., 2004; HUGGETT et al., 2005). Estudos que utilizam o hamster como modelo animal para avaliar a resposta celular gerada pela infecção por leptospiras patogênicas ou por diferentes abordagens vacinais, geralmente utilizam genes universais como controles endógenos (GOMES et al., 2018; LAURETTI-FERREIRA et al., 2020; MATSUI et al., 2011; RAJA et al., 2018). Não há evidência na literatura de nenhum estudo que avalie a expressão de genes endógenos em hamsters nessas condições. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho é identificar e validar genes de referência para hamster sírio dourado em condições de infecção por Leptospira interrogans e vacinação com formulações que utilizam células inteiras inativadas (bacterinas), o adjuvante hidróxido de alumínio ou os vetores vacinais Mycobacterium bovis BCG e Salmonella typhimurium.

2.1 Seleção de candidatos a genes de referência e desenho de primers

Os potenciais genes endógenos a serem usados como referência para análise de expressão gênica relativa em hamster sírio dourado serão selecionados com base em controles internos utilizados para outros roedores, conforme descrito na literatura. Ao total, serão selecionados dez candidatos.

Os pares de primers para a amplificação de cada gene de referência serão projetados com o auxílio do software Vector NTI11 com base na sequência dos transcritos dos genes candidatos. Antes dos ensaios de RT-qPCR, todos os pares de primers serão testados por PCR convencional seguido de eletroforese em gel de agarose, a fim de verificar a especificidade da amplificação por PCR. A eficiência dos primers será verificada por RT-qPCR utilizando o software LinRegPCR.

2.2 Cepas e condições de cultivo

A cepa de Mycobacterium bovis BCG Pasteur será cultivada à 37 °C em meio Middlebrook 7H9 (Difco), com adição de 0,05% de Tween 80, 0,2% de glicerol e 10% de OADC. A cepa de Salmonella enterica sorovar typhimurium será cultivada em meio Luria-Bertani (LB) à 37 °C. A cepa de Leptospira interrogans L1-130 será mantida a 30 °C em meio Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) suplementado com enriquecimento de Leptospira EMJH.

2.3 Amostras e condições experimentais

Serão utilizados hamsters sírios dourados, fêmeas e machos, contendo 4-6 semanas de idade. Os animais serão segregados aleatoriamente em cinco grupos contendo 5 animais cada, os quais serão submetidos às seguintes intervenções: A) infecção com L. interrogans; B) vacinação com ovalbumina + hidróxido de alumínio; C) vacinação com BCG Pasteur; D) vacinação com Salmonella Typhimurium; E) vacinação com bacterina. Os hamsters infectados (grupo A) serão desafiados por via intraperitoneal com 10x ED50 de Leptospira interrogans cepa Fiocruz L1-130 e serão eutanasiados quando apresentarem os sinais clínicos da leptospirose, incluindo perda de 10% do peso, uveíte, prostração e pelo opaco. A administração da vacina aos animais do grupo B será realizada por via intramuscular; os animais do grupo C receberão 106 UFC de BCG Pasteur pela via subcutânea; já os do grupo D receberão 2×109 UFC de S. Typhimurium por via oral; e por fim, os animais do grupo E receberão 108 leptospiras inativadas por via intramuscular. Os animais vacinados serão eutanasiados 21 dias após a segunda dose. Após a eutanásia, será coletado o sangue total através de enxanguinação cardíaca. Além disso, também será coletado o rim, fígado e pulmão de todos os animais.

2.4 Extração de RNA

Para a extração de RNA do sangue total, o sangue será coletado em tubos com o reagente RNAlater e a extração será realizada utilizando o kit RiboPure-Blood (Ambion), de acordo com as instruções do fabricante. Após todas as etapas, o RNA será eluído em 80 µl. A qualidade e a concentração do RNA serão avaliadas no espectrofotômetro NanoVue Plus (GE Healthcare, EUA).
Para a extração de RNA dos órgãos, após a coleta dos tecidos, eles serão cortados em pedaços de ~1 cm3 e incubados com o reagente RNAlater. As amostras serão então homogeneizadas para dois ciclos de 20 segundos utilizando um ribolizador. O RNA total será extraído utilizando o High Pure RNA Tissue Kit (Sigma), conforme as instruções do fabricante. Após todas as etapas, o RNA será eluido em 80 µl e será quantificado por espectrofotometria.

2.5 Síntese de cDNA e PCR quantitativo em tempo real

A síntese de cDNA será realizada utilizando o kit GoScript Reverse Transcription Mix (Promega), seguindo as instruções do fabricante. Posteriormente será analisada a estabilidade da expressão dos candidatos a genes de referência através de PCR quantitativo em tempo real usando SYBR Green PCR Master Mix e equipamento LightCycler 96 (Roche).

2.6 Análise de estabilidade da expressão de genes de referência

A estabilidade da expressão dos candidatos a genes de referência será avaliada estatisticamente através de três softwares baseados no Microsoft Excel: BestKeeper, geNorm e NormFinder. As análises do BestKeeper permitem a entrada de valores de CT brutos, enquanto geNorm e NormFinder exigem que os valores CT brutos sejam convertidos em dados de quantificação relativa, para isso será utilizada a fórmula 2 – ΔCT.

2.7 Impacto da utilização de genes de referência inadequados sobre a expressão de citocinas alvo

A análise da expressão de pelo menos duas citocinas alvo será utilizada para verificar o impacto do uso de genes de referência inadequados sobre a análise da expressão gênica. Para esta finalidade, os genes mais estáveis e instáveis, determinados pelos softwares BestKeeper, geNorm e NormFinder, serão utilizados como controles endógenos para determinar a expressão gênica de citocinas comumente avaliadas na literatura, usando as amostras dos animais infectados e vacinados.

Ao final do projeto, espera-se identificar genes de referência estáveis para análise da expressão gênica relativa em amostras de sangue, rim, fígado e pulmão de hamster sírio dourado sob as condições de infecção por Leptospira spp. e imunização com diferentes formulações vacinais. Dessa forma, pretende-se demonstrar a importância da validação de controles endógenos antes da sua utilização em análises de RT-qPCR, bem como evidenciar o impacto da seleção de genes de referência apropriados na precisão dos resultados obtidos em estudos de determinação do perfil de expressão de genes alvo. Os dados gerados a partir deste projeto trarão importantes contribuições acerca da análise do perfil transcricional de citocinas em hamster sírio dourado como modelo para pesquisas na área de patogênese e eficácia protetora de vacinas contra leptospirose.