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O Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade (TDAH) é o transtorno do neurodesenvolvimento mais comum na infância (CAYE et al., 2016; DEMIRCI et al., 2016). A prevalência mundial de TDAH em crianças e adolescentes varia de 5 - 12% (POLANCZYK, et al., 2007; THOMAS et al., 2015; DEMONTIS et al., 2019; POSNER & GREENHILL, 2013), e estima-se que 50% a 80% dessas crianças continuem a apresentar os sintomas do transtorno na vida adulta (BENCZIK & CASELLA, 2015). No Brasil, a ANVISA e outros estudos relatam uma grande variação na prevalência, com estimativas que variam de 0,9 - 26% (dados revisados em DA HORA et al., 2015; ORTEGA & MÜLLER, 2020). O TDAH está relacionado a disfunção executiva e prejuízo na tomada de decisão, auto monitoramento, memória, atenção, linguagem, controle das emoções e comportamento social. Em conjunto, essas disfunções podem dificultar os relacionamentos afetivos e sociais, e a impulsividade pode desencadear rejeição pelos colegas de escola e professores (POSNER & GREENHILL, 2013).
A etiologia do TDAH é multifatorial, e os possíveis fatores de risco no desenvolvimento do transtorno ainda não foram completamente identificados. Entretanto, já se sabe que a etiologia compreende interações complexas de sistemas de neurotransmissores e alterações neuroanatômicas (BARI & ROBBINS, 2013; HOOGMAN et al., 2017). Estudos epidemiológicos e clínicos sugerem que fatores de risco genéticos e ambientais afetam a estrutura e capacidade funcional das redes cerebrais envolvidas no comportamento e cognição (DEMONTIS et al., 2019). De relevância, estudos com gêmeos indicam que a herdabilidade é de 70-80% ao longo da vida (DEMONTIS et al., 2019). Assim, diversas evidências apoiam causas genéticas onde vários genes estejam envolvidos, entretanto, a busca não é por um gene específico de TDAH, mas sim por genes que regulam o funcionamento cerebral (DEMONTIS et al., 2019).
Dentre os sistemas biológicos envolvidos na neurobiologia dos distúrbios do desenvolvimento e do comportamento, e de interesse na investigação do TDAH e seus endofenótipos, surge o sistema da via oxitocina-vasopressina. A oxitocina (OT) e a arginina vasopressina (AVP) são neuropeptídeos sintetizados no hipotálamo e secretados pela hipófise posterior (BARIBEAU & ANAGNOSTOU, 2015). Os genes dessa via influenciam os níveis destes neuropeptídeos no cérebro, os quais, através de seus resceptores específicos, demonstraram modular regiões cerebrais hipotalâmicas ou límbicas (BARIBEAU & ANAGNOSTOU, 2015), explicando sua influência no desenvolvimento de habilidades sociais e emocionais (CARTER, 2014) e comportamentos que compõem déficits de habilidades sociais (DOLEN, 2015).
De fato, há ampla pesquisa que sugere que variações genéticas na estrutura do receptor para essas moléculas pode afetar alguns aspectos do funcionamento social em humanos; além disso, a administração central de OT parece estimular certos comportamentos sociais e capacidades cognitivas (MEYER-LINDENBERG et al., 2011). Estudos também relataram níveis de OT circulantes mais baixos em indivíduos com TDAH em comparação com controles, sugerindo que a OT pode desempenhar um papel na patogênese do transtorno (SASAKI et al., 2016). Em amostras de adultos, estudos mostraram o envolvimento de AVPR1A na relação interpessoal (WALUM et al., 2008) e empatia cognitiva (UZEFOVSKY et al., 2015). Já estudos sobre o AVPR1B em humanos mostram evidências de que esse gene afeta a agressividade em crianças (LUPPINO et al., 2014; ZAI et al., 2012), enquanto estudos em animais mostraram envolvimento de AVPR1B na motivação social e memória social (WERSINGER et al., 2004).
Essa linha de raciocínio sugere que variações genéticas, como os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), dentro dos genes envolvidos nessa via são uma forte estratégia complementar para a compreensão do papel sistema OT-AVP no TDAH e também em seus endofenótipos. De fato, achados de estudos amplos do genoma estabelecem que a arquitetura genética dos transtornos psiquiátricos e do desenvolvimento é altamente poligênica. Entretanto, embora a contribuição individual de cada variante seja pequena, o efeito cumulativo desses SNPs tem uma contribuição substancial, e assim, a identificação desses genes se faz importante para desvendar os mecanismos biológicos compartilhados entre o transtorno, o direcionamento de estudos funcionais, de determinação de novos alvos terapêuticos e diagnóstico diferencial. Assim, a presente proposta tem plausibilidade científica por demonstrar novos possíveis alvos genéticos compartilhados no TDAH e seus endofenótipos, que interagindo com fatores ambientais possam melhor diagnosticar e tratar os indivíduos acometidos por esse transtorno.
Para isso, o uso de duas abordagens se torna importante: uma abordagem baseada em uma pontuação de escore de risco poligênico específica para o sistema OT-AVP, usada para elucidar o risco cumulativo de certos SNPs; e a abordagem baseada em genes, que permite interrogar conjuntamente todos os SNPs dentro de um gene. Espera-se que tomar o gene como unidade de análise aumente o poder estatístico em relação à análise de um único SNP, porque é responsável por várias variantes funcionais independentes enquanto diminui o número de testes estatísticos.

Delineamento e Participantes
O delineamento epidemiológico consiste em uma coorte de nascimentos de base populacional de 2004 localizada na cidade de Pelotas, no estado do Rio Grande do Sul, sul do Brasil. Do total de nascimentos ocorridos deste ano, 4.231 crianças foram recrutadas para a coorte. Todos os nascimentos ocorridos em hospitais, na zona urbana dos municípios de Pelotas e Capão do Leão (bairro Jardim América), entre 1º de janeiro a 31 de dezembro de 2004 foram identificados e as mães convidadas para participação do estudo. Do total de nascimentos ocorridos neste ano, 4.231 crianças (equivalente a 99,2% dos nascimentos) foram recrutadas para a coorte.
Um estudo perinatal foi realizado nas primeiras 24 horas depois do parto. No primeiro ano, completaram-se dois seguimentos realizados em domicílio, aos 3 e 12 meses de idade (Tabela 1). Os acompanhamentos seguintes ocorreram aos 24 meses e aos 48 meses em domicílio, e aos 6 e 11 anos de idade no Centro de Pesquisas Epidemiológicas (CPE), construído exclusivamente para atender os participantes das coortes. Aos seis anos de idade, 3.722 participaram do estudo, o equivalente a 88% de taxa de seguimento. Aos onze anos de idade, 3.582 adolescentes (87,0%) participaram do acompanhamento. O seguimento previsto para acontecer aos 15 anos de idade iniciou-se em novembro de 2019 e por ocasião da pandemia do COVID-19 foi suspendido o dia 23 de março de 2020. Neste acompanhamento, 1950 (48,5%) adolescentes participaram do seguimento. Atualmente, encontra-se em andamento o acompanhamento dos 18 anos.
Para esta proposta de projeto, analisarems os dados já coletados da Coorte de Nascimentos de Pelotas 2004, referente aos 6, 11 e 15 anos, seguimentos nos quais foram avaliados os sintomas de desatenção e hiperatividade (6, 11 e 15 anos) e as funções executivas (11 e 15 anos) dos participantes da coorte.

Procedimentos e Instrumentos
Variáveis Independentes
- Escore de risco poligênico específico para a via OT-AVP: Para a análise da associação do escore de risco poligênico (PRS), serão criados dois PRS específicos para genes da via OT-AVP, seguindo as metodologias descritas em Haram et al (2015) e Verhagen et al (2022). Apenas genes relevantes para a funcionalidade da via serão incluídos, os quais foram selecionados a partir de pesquisa na literatura. Assim foram selecionados os genes OXT, OXTR, CD38, AVP, AVPR1A e AVPR1B. As ponderações dos PRS serão baseadas em um GWAS de de funcionamento executivo e velocidade de processamento de informações (Ibrahim-Verbaas et al, 2015) e no último GWAS de TDAH publicado (Demontis et al., 2021).

- Análise de associação baseada em genes e conjuntos de genes: Examinaremos a associação avaliando os genes testados individualmente (análise de associação baseada em gene) e como um cluster (análise de associação de conjunto de genes). Ambas as análises serão realizadas usando o software MAGMA (versão 1.06) e incluirão uma janela de 10 kb upstream e downstream de cada gene. Serão incluídos nas análises os mesmos genes selecionados para a análide de PRS (OXT, OXTR, CD38, AVP, AVPR1A e AVPR1B). Todos os genes estão situados em cromossomos autossômicos fora da região MHC e anotados nos arquivos do MAGMA.

Variáveis dependentes
- TDAH: os sintomas de desatenção e hiperatividade serão avaliados nos acompanhamentos de 6 e 11 anos usando o Questionário de Capacidades e Dificuldades (SDQ, do inglês Strengths and Difficulties Questionnaire), um instrumento projetado para avaliar problemas de saúde mental em crianças e adolescentes. No acompanhamento dos 15 anos, sintomas de desatenção e hiperatividade serão avaliados através do instrumento Avaliação de Desenvolvimento e Bem-Estar (DAWBA, do inglês The Development and Well-Being Assessment), um pacote de questionários, entrevistas e técnicas de classificação projetado para gerar diagnósticos psiquiátricos CID-10 e DSM-IV em crianças de 5 a 16 anos.

- Funções executivas: as funções executivas aos 11 anos serão avaliadas por meio da realização de tarefas contidas no Teste de Atenção Diária para Crianças (TEA-Ch, do inglês (Test-of-Everyday-Attention-for-Children), um teste neuropsicológico desenvolvido para avaliar a natureza multidimensional da atenção e as funções executivas relacionadas em crianças e adolescentes. Aos 15 anos as funções executivas serão examinadas por meio de 3 subtestes contidos na Bateria Automatizada de Testes Neuropsicológicos de Cambridge (CANTAB, do inglês Cambridge Neuropsychological Testing Automated Battery).

Análise de dados
Os dados serão analisados como variáveis contínuas.
Em relação à análise de PRS, ambos os PRS serão construídos usando o Software PRSice, versão 2.2.1 e para a análise de associação genética, a regressão linear será realizada usando STATA, com sexo e os primeiros 10 componentes principais para ancestralidade incluídos como covariáveis.
Em relação à análise de associação de conjunto de genes, ambas as análises baseadas em genes e de conjuntos de genes serão realizadas usando o software MAGMA, versão 1.06. Para o teste de associação baseado em genes, usaremos o limite de significância ajustado por Bonferroni e para a análise do conjunto de genes, será utilizado um modelo competitivo. Sexo e os 10 primeiros componentes principais para ancestralidade serão incluídos como covariáveis.

Indicadores e Metas
- Identificar os genes do sistema OT-AVP para a construção de PRS e para a análise de associação baseada em genes e conjunto de genes – Indicador: Elaboração de lista com o nome, símbolo, código de indentificação, posição cromossômica e função dos genes do sistema OT-AVP. Até final de janeiro de 2023.
- Criação do PRS para o sistem OT-AVP – Indicador: Elaboração de banco de dados com o escore individual para os participantes da coorte. Até final de março de 2023.
- Criação das trajetórias de TDAH. Indicador: Elaboração de banco de dados com as variáveis. Até final de maio de 2023.
- Seleção e construção das variáveis de endofenótipos a serem empregadas no estudo. Elaboração de banco de dados com as variáveis. Até final de maio de 2023.
- Associação e redação das análises de PRS e genes com TDAH – Indicador: Manuscrito a ser submetido em periódico internacional A1. Até final de agosto de 2023.
- Associação e redação das análises de PRS e genes com alterações neuropsicológicas e função executiva – Indicador: Manuscrito a ser submetido em periódico internacional A1. Até final de dezembro de 2023.
- Realização das análises empregando estatísticas sumarizadas de grandes estudos de GWAS. Indicador: Obtenção de estatísticas para correlaçãoes, associação baseada em genes e em conjunto de genes. Até final de agosto de 2024.
- Redação dos resultados da meta acima. Indicador: Manuscrito a ser submetido em periódico internacional A1. Até final de novembro de 2024.

Resultados Esperados
Os transtornos do neurodesenvolvimento, como o TDAH, são caracterizados por manifestações afetivas, comportamentais, com altas taxas de comorbidades,. Um fator limitante ainda presente os dias atuais é o diagnóstico essencialmente clínico realizado com base nos sinais e sintomas do transtorno de acordo com o “Manual Diagnóstico e Estatístico dos Transtornos Mentais (DSM-V)”. Além disso, o ainda limitado conhecimento sobre a neurobiologia da etiologia do TDAH faz com que os medicamentos tenham como alvo apenas os sintomas desse transtorno, tornando-os muitas vezes ineficazes, com ação tardia e diversos efeitos colaterais. Para que exista uma inovação a nível de medicamentos, é necessário que os tratamentos abordem as respostas patológicas causais. Nesse sentido, como os genes do sistema OT-AVP se mostram promissores nos estudos de genética psiquiátrica e do neurodesenvolvimento, compreender os mecanismos moleculares envolvidos nos seus efeitos e expressão, podem ser um importante avanço para um tratamento que aborde as causas e não apenas os sintomas.
Assim, com este projeto, pretende-se contribuir para um maior entendimento acerca da relação entre o TDAH e seus endofenótipos de funções executivas, com grande enfoque no sistema da via OT-AVP. Nossos dados fornecerão informações com maior poder a cerca da influência deste sistema no TDAH e sua natureza altamente poligênica, uma vez que atualmente os estudos relacionados à esta temática possuem amostras relativamente pequenas e com análise de poucas variantes genéticas. Ainda, a presente proposta representa um projeto inovador. Primeiramente, o estudo tem um delineamento longitudinal e englobará dados de diversas faixas etárias, o que permitirá estabelecer a relação entre o sistema OT-AVP em um contexto de trajetórias dos sintomas ao longo da vida. Essa abordagem incluindo dados com coleta em diversos pontos da vida e estabelecendo como exposição o componente genético da via OT-AVP em análises robustas é inexistente na literatura, tornando este projeto inédito. Importante de ressantar também é o fato da proposta ser baseada em uma amostra de base populacional representativa da população e com alta taxa de retenção. Adicionalmente, avaliações detalhadas de testes neuropsicológicos e de função executiva em amostras de coorte populacional são raros na literatura. Em geral esses estudos são restritos a pequenos tamanhos amostrais eamostras clínicas, dado o seu custo e complicações em logísticas de aplicação. A avaliação de diferentes domínios, por testes neuropsicológicos com qualidade de aplicação, durante o fim da infância e na adolescêscia, conduzidos por profissionais da área da psicologia treinados e padronizados, fornecem desfechos objetivos e inéditos na literatura.
Este projeto resultará em, no mínimo, três artigos científicos. Considerando a originalidade da presente proposta de pesquisa, a expectativa inicial é de que os resultados sejam publicados em periódicos científicos com maior fator de impacto (Qualis A1), o que gerará visibilidade para a ciência brasileira, possibilitando futuras colaborações e inserção internacional do grupo de pesquisas. Ainda, esperamos que os resultados deste estudo sejam apresentados em eventos científicos nacionais e internacionais,como o Congresso de Genômica Psiquiátrica, referência internacional no tema, contribuindo para a formação de redes colaborativas. Além do conhecimento científico, os resultados esperados desta proposta de pesquisa envolvem: (1) a formação de capital humano, com a participação de alunos de graduação e pós-graduação, que serão orientados pela proponente e pela bolsista PDJ; e (2) a possibilidade de expansão da área de epidemiologia genética no Programa de Pós-graduação em Epidemiologia e na Universidade Federal de Pelotas, uma vez que o volume de trabalho e o aporte de recursos financeiros permitirão o acesso e o envolvimento de novos colaboradores neste projeto.