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A leptospirose é uma das zoonoses bacterianas de maior disseminação global associada a significativo impacto na saúde humana e animal (Costa et al., 2015). A infecção estabelecida nos homens e nas mais diversas espécies animais na natureza é causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira. Genomicamente, o gênero subdivide-se em 69 espécies das quais 20 são classificadas como patogênicas (Fernandes et al., 2022; Korba et al., 2021; Vincent et al., 2019) e potencialmente associadas ao estabelecimento de infecções mais graves. Adicionalmente, leptospiras são classificadas sorologicamente com base na composição de lipopolissacarídeos da superfície celular, sendo atualmente reconhecidos mais de 300 sorovares, dos quais mais de 260 são classificados como patogênicos (Adler and Moctezuma, 2010; Vincent et al., 2019).
O contato próximo entre pessoas e seus animais de estimação, associada a presença de roedores e más condições sanitárias, são fatores significativos para o aumento do potencial zoonótico da infecção por Leptospira spp. (Bharti et al., 2003), reforçando a necessidade de que as estratégias de prevenção sejam analisadas à luz da Saúde Única (Polo et al., 2019). Preparações de células inteiras inativadas (bacterinas) são mundialmente aplicadas em cães e animais de produção para o controle da doença, entretanto ainda é frequente na literatura o relato de eficácia variável destas formulações. Dentre as limitações mais frequentemente reportadas estão a baixa imunogenicidade, necessidade de reforços semestrais para a manutenção da proteção e falha na prevenção da colonização renal e excreção urinária, permitindo com que animais infectados sigam como portadores, eliminando a bactéria no ambiente (André-Fontaine et al., 2003; Bernardus et al., 2022; de Oliveira et al., 2021; Martins et al., 2018; Sonada et al., 2018; Suepaul et al., 2010). Um estudo recente (Bergmann Esteves et al., 2022) demonstrou que as bacterinas comerciais para o controle da leptospirose canina apresentam ~84% de eficácia contra a doença clínica e 88% contra o status de portador renal. Estes níveis de proteção demonstram-se inconsistentes em diversas marcas de vacinas, especialmente contra os sorovares Canicola, Australis e Grippotyphosa. Desta forma a melhoria da imunogenicidade e qualidade das bacterinas utilizadas no controle da leptospirose deve ser uma prática constante nos setores de P&DI da indústria de vacinas para a obtenção de bacterinas mais eficazes que possam bloquear a proliferação da Leptospira no ambiente e conferir proteção satisfatória contra doença clínica. Adicionalmente, o desenvolvimento paralelo de novas vacinas recombinantes é uma abordagem promissora visando uma futura associação às bacterinas a fim de melhorar o espectro e qualidade das vacinas utilizadas no controle da leptospirose.

Obtenção e cultivo das cepas
Cepas virulentas de L. interrogans sorovares Canicola, Copenhageni e Pomona serão obtidas do banco de cepas do Laboratório de Vacinologia do CDTec-UFPel. As cepas vacinais serão cedidas pela Vaxxinova através de um MTA (Material Transfer Agreement) à UFPel. Todas as cepas serão cultivadas em meio Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) (Difco; BD, Brasil) líquido enriquecido com 10% de suplemento comercial (Difco, BD, Brasil) a 30 °C. As cepas virulentas serão estocadas em nitrogênio líquido (com 2,5% de DMSO) até o momento do uso.

Caracterização genética das cepas vacinais
Cultivos das cepas vacinais mantidos em meio EMJH em fase exponencial (~2×10e8 cel/ml) serão utilizados para extração de DNA genômico utilizando o kit Bacterial Genomic DNA purification (Invitrogen), seguindo protocolo recomendado para bactérias Gram negativas. Após a extração a qualidade das amostras de DNA será analisada por eletroforese em gel de agarose, seguida de quantificação por fluorometria (Qubit® - Invitrogen) e análise da pureza por espectrofotometria (NanoVue – GE Heathcare). Amostras serão acondicionadas a -20 °C até o processamento. O DNA obtido será utilizado para análise de Variable-number Tandem Repeats (VNTR) realizado com sete primers discriminatórios previamente descritos (Majed et al., 2005). Adicionalmente, uma fração de cada DNA genômico extraído será enviada a uma empresa especializada para realização de sequenciamento em plataforma de nova geração (NGS). Após o sequenciamento todos os dados serão analisados por bioinformatas especializados do Núcleo de Biotecnologia da UFPel.

Análises de imunogenicidade das cepas vacinais
MAT, ELISA indireto e Western blot
Para as análises de imunogenicidade bacterinas monovalentes de sorovares de interesse serão produzidas pela empresa Vaxxinova e enviadas ao Laboratório de Vacinologia da UFPel. Para os ensaios serão utilizados hamsters sírios dourados (Mesocricetus auratus) fêmeas e machos, com 5-6 semanas de idade, procedentes do Biotério Central da UFPel. Grupos de quatro hamsters (duas fêmeas e dois machos cada) serão imunizados com 0,25 mL de cada bacterina monovalente, por via subcutânea, na diluição de 1:40 da dose original (1 mL). Decorridos 18 dias da vacinação, os animais serão anestesiados com sobredose anestésica seguida de punção cardíaca para coleta de sangue total. O soro será separado por centrifugação e armazenado a –20 °C. Os soros obtidos de cada grupo imunizado (N=4) serão reunidos em pools e utilizados para mensurar os níveis de aglutininas antileptospiras pelo Teste de Microaglutinação (MAT). Culturas vivas dos sorovares utilizados nas formulações serão utilizadas como antígenos conforme previamente descrito (Faine et al., 1999).
Os soros obtidos também serão utilizados para tiltulação por ELISA indireto conforme protocolo previamente descrito (de Oliveira et al., 2021). Como antígenos serão utilizados os extratos das cepas vacinais. Adicionalmente, a técnica de Western blot será utilizada para avaliar a reatividade dos pools de soros obtidos frente a proteínas recombinantes imunogênicas de Leptospira spp. disponíveis no Laboratório de Vacinologia conforme previamente descrito (de Oliveira et al., 2021).

Teste de inibição do crescimento in vitro
Alíquotas dos pools de soros obtidos serão inativadas e diluídas em escala geométrica de razão dois (1:2 a 1:32) em solução salina tamponada (PBS). Para cada diluição de soro serão realizadas duas repetições em tubos contendo 2,5 mL de meio EMJH, 0,2 mL do soro a ser testado e 0,1 mL de cultura de leptospiras vivas conforme protocolo previamente descrito (Rodrigues et al., 2013).

Avaliação da eficácia das bacterinas em hamsters (vacina polivalente)
As cepas de Leptospira spp. aprovadas nos ensaios de imunogenicidade serão utilizadas para produção da vacina polivalente associadas a um ou mais adjuvantes. As bacterinas serão produzidas com tecnologia da empresa Vaxxinova e enviadas ao Laboratório de Vacinologia da UFPel. Para os testes de potência serão utilizados hamsters sírios dourados fêmeas e machos, com 5-6 semanas de idade, procedentes do Biotério Central da UFPel. Antes de iniciar os ensaios, os animais serão identificados individualmente e então divididos aleatoriamente em grupos de dez animais cada.
Em todos os experimentos os animais receberão uma dose de 0,25 mL de cada formulação vacinal administradas por via subcutânea/intramuscular (diluídas em água para injeção equivalente a 1:40 da dose para a espécie alvo, conforme normas da monografia do Code of Federal Regulation, 2017. 9 - Part 113 - Standard Requirements. § 113.101 a § 113.105 e da Farmacopeia Europeia para os testes de potência de vacina). Amostras de sangue serão coletadas através da punção da veia de maior calibre entre os dentes incisivos inferiores nos dias 0 (pré-vacinação) e 17 pós-vacinação. Antes de realizar a coleta de sangue os animais serão submetidos a leve anestesia com isoflurano. O soro será separado por centrifugação e armazenado à -20 °C até a sua utilização. Aos 18 dias pós imunização os animais serão desafiados com inóculos letais de L. interrogans sorovares Canicola cepa LO-4, Pomona cepa Pomona ou Copenhageni cepa L1-130 e monitorados diariamente durante 14 dias. Animais com sinais clínicos de leptospirose e moribundos serão eutanasiados conforme normas e regulamentos do CONCEA. Os critérios utilizados para determinar o momento da eutanásia serão: perda de 10% do peso máximo, prostração, pelo eriçado, apatia, falta de apetite, hematúria, uveíte e hemorragia. Ao final do experimento os animais sobreviventes serão eutanasiados e necropsiados, e posteriormente congelados e entregues ao Biotério Central da UFPel, que os encaminha para incineração. Vacinas serão consideradas válidas se atingirem o mínimo de 80% de proteção (8/10) nos grupos vacinados e 80% de letalidade (8/10) no grupo controle negativo (PBS).

Avaliação da eficácia da vacina recombinante experimental em hamsters
A vacina experimental será fornecida pela empresa Vaxxinova e enviada ao Laboratório de Vacinologia da UFPel. Os testes de potência serão realizados conforme previamente descrito para os ensaios com bacterinas com as seguintes modificações: os animais receberão duas doses de até 0,25 mL da formulação vacinal administrada por via subcutânea/intramuscular contendo 50- 200 µg de antígeno por dose com 14 dias de intervalo. Amostras de sangue serão coletadas através da punção da veia de maior calibre entre os dentes incisivos inferiores nos dias 0 (pré-vacinação), 14 e 28 pós 1ª dose. Aos 28 dias pós 1ª dose os animais serão desafiados com inóculos letais de L. interrogans sorovares Copenhageni cepa L1-130, Canicola cepa LO-4 ou Pomona cepa Pomona e monitorados diariamente durante 28 dias.

Avaliação da eficácia das bacterinas em hamsters (vacinas monovalentes)
A metodologia do ensaio das vacinas monovalentes em hamster será definida se a empresa Vaxxinova aprovar a continuidade do projeto.

Avaliação da resposta imune induzida pelas vacinas
A resposta imune humoral de todos os ensaios será avaliada por ELISA e MAT. Adicionalmente secções de rim, fígado e pulmão serão coletadas e estocadas a –70 ºC para posterior extração de DNA e análise de imunidade esterilizante por PCR quantitativo em tempo real (qPCR) conforme previamente descrito (de Oliveira et al., 2021).

Análise estatística
Os testes de Fisher e Wilcoxon log-rank serão utilizados para determinar diferenças significativas nas taxas de mortalidade e sobrevivência dos grupos, respectivamente. Análise de variância (ANOVA) será utilizada para determinar diferenças significativas nos ensaios sorológicos. Diferenças serão consideradas significantes com um valor de P < 0,05. Todas as análises serão conduzidas no software GraphPad Prism v.8 (GraphPad Software).

Espécies patogênicas do gênero Leptospira vivem nos rins de diferentes espécies de mamíferos e são excretadas pela urina. Os cães têm alto risco de exposição as leptospiras devido ao contato constante com fontes de água infectadas e alimentos expostos a água contaminada ou potencialmente infectados por roedores (de Oliveira et al., 2022; Narkkul et al., 2021). Atualmente as bacterinas comercialmente disponíveis para o controle da doença em cães e em outras espécies, apresentam diversas limitações quanto ao espectro de proteção. Com este projeto, buscamos otimizar o processo de produção de bacterinas para leptospirose canina objetivando a comercialização de um produto com melhor eficácia no mercado. Adicionalmente a análise paralela de uma formulação recombinante com elevado potencial biotecnológico poderá agregar a eficácia do produto final. O desenvolvimento deste projeto visa à geração de um produto capaz de induzir imunidade protetora em animais, mais especificamente em cães, impactando positivamente no setor veterinário e consequentemente na saúde pública pela redução do risco de exposição a humanos que vivem em contato próximo com esses animais.
Este projeto fará parte de um convênio firmado com a empresa Vaxxinova (atende o mercado pet com a marca Biovet), uma indústria que gera produtos para o setor veterinário, que irá fornecer as formulações finais das bacterinas conforme descrito na metodologia. Com os resultados obtidos esperamos realizar o depósito de pedidos de patentes e publicações de trabalhos em periódicos científicos internacionais em colaboração com a empresa. Por fim, este estudo também permitirá o treinamento e formação de mão de obra qualificada de estudantes de graduação e pós-graduação e a consolidação desta área de pesquisa junto à UFPel.