O projeto será desenvolvido no Laboratório de Engenharia Genética Animal, com o apoio do
Laboratório de Ictiologia, ambos localizados na Universidade Federal de Pelotas (UFPel).
Para o desenvolvimento do projeto as bibliotecas de DNAs, das diferentes espécies, foram
fornecidas pela Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo – USP,
ao qual foram preparadas a partir de 20 ng de DNA genômico de acordo com o protocolo padrão do
Kit Illumina Nextera DNA Library (Illumina,USA) e conduzido em um sequenciador GAIIx (Illumina,
USA) com leituras de 150 pares de bases.
As leituras obtidas do sequenciamento serão analisadas com o programa
PAL_FINDER_v.0.02.03, instalado em um computador com sistema operacional LINUX. Serão
identificados como microssatélites (SSRs) dinucleotídeos (2mer), trinucleotídeos (3mer),
tetranucleotídeos (4mer), pentanucleotídeos (5mer) e hexanucleotídeos (6mer), se contiverem
repetições simples de pelo menos 12 pb de comprimento para 2mer, 3mer e 4mers e, pelo menos,
três repetições para 5mers ou 6mers.
Após a identificação os microssatélites serão agrupados para um subdiretório local do programa
Primer3 v.2. Serão utilizados os seguintes critérios para o desenho de primers: conteúdo GC superior
a 30%; temperaturas de anelamento de 58 – 65°C com uma diferença máxima entre 2°C entre o par;
os dois últimos nucleotídeos 3’ sendo G ou C e poli-N de no máximo quatro nucleotídeos. Todos os
outros parâmetros serão ajustados para valores padrão do Primer3.
Os loci SSRs, que apresentarem sequências flanqueantes bastantes adequadas para desenho de
primers, serão chamados de Loci Potencialmente Amplificáveis (PALs) e os PALs que apresentarem
unidades longas de repetições (4mers, 5mers e 6mers) e trechos mais longos de repetições (mais de
7 unidades de repetições observadas), chamados de “Best PALs” (bPALs).
Para a validação dos bPALs serão utilizados DNAs genômicos totais extraídos, de amostras de
nadadeiras caudais, por separação orgânica pelo protocolo de Cloreto de Sódio (BARRERO et al.,
2008). Para checagem da integridade do DNA obtido, as amostras serão submetidas a eletroforese
horizontal com gel de agarose 1% e tampão SB 1X durante 30 minutos a 120 volts e posteriormente
visualizados em transiluminador.
Após a extração de DNAs serão realizadas PCR e eletroforeses em gel de poliacrilamida a 8%,
corados pelo método do nitrato de prata e fotografados com câmera digital. Para análise
semiautomática das bandas observadas nos géis, será utilizado o programa Image Master - Totallab4
versão 1.0.
O coeficiente de endogamia da população (Fis), o número de alelos observados (N), as
frequências alélicas, genotípicas e o equilíbrio de Hardy-Weinberg serão calculados utilizando o
programa Genepop web v. 3.15.