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A consolidação de um programa de melhoramento genético está fundamentada no conhecimento da variabilidade genética da população base e a realização de análises específicas para o monitoramento da
mesma. Os marcadores microssatélites possuem características ideais para estudos de variabilidade genética em peixes por se apresentarem imparciais em relação a efeitos fenotípicos, pelo seu alto grau de polimorfismo e por serem codominantes. Essa característica permite inclusive a observação do comprimento dos alelos herdados, possibilitando a identificação de homozigotos e heterozigotos, desse modo, os dados obtidos através dos marcadores são analisados pelos modelos estatísticos clássicos utilizados na genética
populacional e proporcionando identificar grau de endogamia, direcionando os acasalamentos.

O projeto será desenvolvido no Laboratório de Engenharia Genética Animal, com o apoio do
Laboratório de Ictiologia, ambos localizados na Universidade Federal de Pelotas (UFPel).
Para o desenvolvimento do projeto as bibliotecas de DNAs, das diferentes espécies, foram
fornecidas pela Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo – USP,
ao qual foram preparadas a partir de 20 ng de DNA genômico de acordo com o protocolo padrão do
Kit Illumina Nextera DNA Library (Illumina,USA) e conduzido em um sequenciador GAIIx (Illumina,
USA) com leituras de 150 pares de bases.
As leituras obtidas do sequenciamento serão analisadas com o programa
PAL_FINDER_v.0.02.03, instalado em um computador com sistema operacional LINUX. Serão
identificados como microssatélites (SSRs) dinucleotídeos (2mer), trinucleotídeos (3mer),
tetranucleotídeos (4mer), pentanucleotídeos (5mer) e hexanucleotídeos (6mer), se contiverem
repetições simples de pelo menos 12 pb de comprimento para 2mer, 3mer e 4mers e, pelo menos,
três repetições para 5mers ou 6mers.
Após a identificação os microssatélites serão agrupados para um subdiretório local do programa
Primer3 v.2. Serão utilizados os seguintes critérios para o desenho de primers: conteúdo GC superior
a 30%; temperaturas de anelamento de 58 – 65°C com uma diferença máxima entre 2°C entre o par;
os dois últimos nucleotídeos 3’ sendo G ou C e poli-N de no máximo quatro nucleotídeos. Todos os
outros parâmetros serão ajustados para valores padrão do Primer3.
Os loci SSRs, que apresentarem sequências flanqueantes bastantes adequadas para desenho de
primers, serão chamados de Loci Potencialmente Amplificáveis (PALs) e os PALs que apresentarem
unidades longas de repetições (4mers, 5mers e 6mers) e trechos mais longos de repetições (mais de
7 unidades de repetições observadas), chamados de “Best PALs” (bPALs).
Para a validação dos bPALs serão utilizados DNAs genômicos totais extraídos, de amostras de
nadadeiras caudais, por separação orgânica pelo protocolo de Cloreto de Sódio (BARRERO et al.,
2008). Para checagem da integridade do DNA obtido, as amostras serão submetidas a eletroforese
horizontal com gel de agarose 1% e tampão SB 1X durante 30 minutos a 120 volts e posteriormente
visualizados em transiluminador.
Após a extração de DNAs serão realizadas PCR e eletroforeses em gel de poliacrilamida a 8%,
corados pelo método do nitrato de prata e fotografados com câmera digital. Para análise
semiautomática das bandas observadas nos géis, será utilizado o programa Image Master - Totallab4
versão 1.0.
O coeficiente de endogamia da população (Fis), o número de alelos observados (N), as
frequências alélicas, genotípicas e o equilíbrio de Hardy-Weinberg serão calculados utilizando o
programa Genepop web v. 3.15.

Utilizar métodos eficientes para identificar marcadores moleculares para diferentes espécies de peixes e depositar as sequências microssatélites na base de dados de sequências genéticas (GenBank) do “National Center for Biotechnology Information (NCBI)”.
Disponibilizar, para comunidade científica, as sequências de marcadores microssatélites com capacidade de identificar a perda da variabilidade genética de populações de peixes. As bibliotecas de Loci Potencialmente Amplificáveis de marcadores microssatélites poderão ser aplicadas em diversas populações de diferentes espécies de peixes, com foco na análise de variabilidade e diversidade genética. Com isso será possível uma tomada de decisão e a elaboração de metodologias eficazes para conservação de recursos pesqueiros. Também o conhecimento sobre a variabilidade genética e os padrões de estrutura das populações auxiliará no desenvolvimento de estratégias para as pisciculturas, através de futuros programas de melhoramento genético.