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A saúde mental e as doenças neurológicas representam desafios globais significativos, impactando um bilhão de indivíduos mundialmente. Até 2017, um bilhão de pessoas no mundo sofreu um ou mais transtornos mentais e doenças neurologicas, incluindo condições como depressão, ansiedade, esquizofrenia, Doença de Alzheimer, e Parkinson (Dua et al., 2006; Ritchie 2018;). Essas condições afetam indiscriminadamente, observando-se prevalências alarmantes em todas as faixas etárias, desde a infância até a terceira idade (Moitra et al.,2023). No contexto brasileiro, mais de 30 milhões de pessoas enfrentam distúrbios neuropsiquiátricos, com um número crescente de casos de doenças neurodegenerativas (Marinho et al., 2018; Ritchie 2018).
A patogênese destas alterações mentais e neurodegenerativas pode envolver alterações intrínsecas ao tecido do SNC, permissividade do endotélio à adesão de células inflamatórias e invasão do SNC, com geração de neuroinflamação, infecções in situ no SNC, infecções sistêmicas e geração de perfil inflamatório sistêmico (Barbosa et al., 2021). De fato, foi demostrado que o nível de interleucina (IL)-1 β, em pacientes com DA, se relaciona com maior declínio cognitivo, que pode persistir por até dois meses após a resolução da infecção (Holmes et al., 2003), adicionalmente, o uso de interferon alfa (IFNα) para tratar hepatite C induziu depressão e ansiedade nos pacientes tratados (Maes et al., 2001). Assim, processos que atingem diretamente o SNC, com neuroinflamação, ou infecções sistêmicas, como ativação do sistema imune, poderiam contribuir para alterações comportamentais e neurocognitivas.
Diversos estudos sugerem que portadores crônicos da toxoplasmose, doença causada pelo protozoário Toxoplasma gondii, apresentam alterações comportamentais (Flerg et al., 2002; Arling et al., 2009; Fekadu et al., 2010; Postolache et al., 2021) e neurocognitivas (Berrett el al., 2017; Fernandes et al., 2020). Evidências como a redução volume da substância cinzenta do cérebro de pacientes com esquizofrenia soropositivos para o T. gondii, quando comparados à pacientes esquizofrênicos soronegativos (Horacek, 2012), e alterações comportamentais, como a perda de medo, deficiência na aprendizagem e memória, ansiedade, depressão e hiperatividade em modelos de infecção crônica experimental (Vyas et al., 2007, Ingram et al., 2013; Corrêa et al., 2014; Castaño et al., 2021), tem servido de base para a demonstração das alterações causadas pelo parasito.
Por outro lado, T. gondii persistem no SNC, acometendo células da glia, como astrócitos e micróglias, promovendo o caráter crônico da infecção (Jones et al., 1986; Rozenfeld et al., 2003). Na infecção do SNC, a resposta imune é desencadeada com participação de citocinas, como interferon-gama (IFNɣ) e fator de necrose tumoral (TNF) (Evering, 2006). Tanto IFNγ quanto TNF favorecem a entrada e o crescimento do parasito Trypanosoma cruzi em astrócitos, possíveis fontes de parasito na reativação da infecção em situação de imunossupressão, podendo contribuir para mecanismos patogênicos (Silva A. et al., 2015: Silva R. et al., 2017;). Ainda é desconhecida a participação de IFNɣ e TNF na persistência do T. gondii no SNC. A infecção de astrócitos pelo T. gondii leva à produção de interleucina 10 (IL-10), que induz redução da produção de óxido nítrico (NO) por micróglias ativadas por IFNɣ (Rozenfeld et al., 2003). Contudo, o IFNɣ favorece a replicação do vírus de imunodeficiência humana (HIV) em astrócitos, por alterar vias relacionadas ao controle da replicação do vírus, de modo dependente de STAT3 (Li et al., 2011). Também, TNF favorece a invasão das linhas de células epiteliais por T. cruzi pela ativação da via NF-kB (Pinto et al., 2011). Assim, IFNɣ, TNF e IL-10 poderiam participar da patogênese de doenças infecciosas (por vírus e protozoários), favorecendo a persistência do patógeno em astrócitos. Neste projeto, propomos analisar os mecanismos biológicos e moleculares pelo qual a infecção pelo Toxoplasma gondii, contribue para o desenvolvimento e progressão de alterações de comportamento e cognitivas ou neurodegenerativas, para tal pesquisaremos (i) se a infecção experimental pelo T. gondii induz redução da matéria cinzenta, atrofia cerebral e alteração da morfologia dos neurônios, à medida que a infecção cronifica (ii) comportamento de citocinas pro inflamatórias no SNC ao longo da cronificação da infecção e (iii) papel do IFNɣ, TNF e IL-10 na persistência de T. gondii nas células do SNC.

Modelo in vivo
Considerações éticas:
Seguindo o princípio das 3R (Reduction, Replacement and Refinement), este projeto pretende utilizar tecidos cerebrais previamente obtidos no projeto: “Mecanismos moleculares que favorecem a persistência do T. gondii no sistema nervoso central e sua relação com as alterações da memória”, Licencia CEUA/IOC: L-014/2018- A1. Este projeto também foi submetido à Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Pelotas – UFPel, através do Sistema de Controle de Processos, sob o número de processo 23110.007227/2024-10 para obter a aprovação do uso de tecidos animais.
Obtenção de tecidos cerebrais e modelo experimental:
Brevemente, camundongos C57BL/6 de 4 semanas, foram infectados por gavagem com 5 cistos da cepa Me-49, previa aprovação do Comite de ética. Os animais foram mantidos no biotério do prédio Cardoso Fontes, do Instituto Oswaldo Cruz -IOC, Rio de Janeiro, em caixas de polipropileno com cama de pinus, baixo condições ambientais controladas, ciclo luz- escuro 12 horas, e água e ração ad libitum. Os animais foram eutanasiados em diferentes pontos de infecção após a cronificação da infecção: 30, 60 e 90 dias após a infecção (dpi). Os tecidos foram coletados e conservados no freezer -80 ou em Tissue-Tek compound, para sua posterior processamento e análise.
Quantificação de carga parasitária no SNC: a carga parasitária no SNC será quantificada a partir de DNA extraído de tecidos cerebrais. Por qRT-PCR será detectada a presença do DNA de T. gondii (Lin et al., 2000).
Análises de imunoistoquímica (IHS): os encéfalos coletados serão submetidos à IHS para identificar o volume da matéria cinzenta (Anticorpo S100β e anticorpo Nogo-A) (Chen et al., 2019) e sinais de atrofia cerebral
Análise histológica: a integridade estrutural dos neurônios será avaliada através da microscopia de luz, utilizando a coloração de Nissl (Chen et al., 2019)
Análise da expressão gênica de citocinas: mRNA dos tecidos cerebrais do córtex e hipocampo será extraído para a realização de qRT-PCR. O cDNA será produzido a partir de 2,5 μg de RNA, previamente tratado com DNAse (Sigma, EUA), utilizando o kit SuperScript® III VILO™ MasterMix (Thermo Fisher Scientific, EUA). Para quantificação da expressão gênica das citocinas será utilizado o sistema TaqMan® TNF (Mm00443258-m1) e IFNγ (Mm01168134_m1), segundo o fabricante. Como controles endógenos usaremos GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase) e HPRT (hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase), como descrito (Vilar-Pereira et al., 2012).
Estudo da expressão de moléculas alvo do estudo por Western blotting: será realizada extração de proteína na presença de inibidores de proteases. As proteínas totais serão fracionadas por SDS-PAGE (10%) e transferida para membrana de nitrocelulose. A detecção de alvos de interesse, STAT3 e NF-ҡB, será feita usando anticorpos específicos em diluições apropriadas. Como controles endógenos e normalizadores, que permitirão análise quantitativa, usaremos as proteínas GAPDH, HPRT, MEKK1. A revelação será por anticorpo secundário-peroxidase e visualização por quimioluminescência. As imagens serão adquiridas em densitômetro e análise com o programa QuantityOne (BioRad).

Modelos in vitro
Cultivo de micróglia: células da linhagem microglial murina imortalizada BV-2 serão cedidas pelo Laboratório de Enzimologia Toxicológica da Universidade Federal de Santa Maria- UFSM. As células serão cultivadas na densidade 2,5X105 em meio Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Sigma-Aldrich).
Infecção das células da micróglia: para a infecção in vitro, será utilizada a cepa ME-49 do T. gondii. Os parasitos serão obtidos de cultivos em linhagem de células VERO. Formas infectantes serão adicionadas aos cultivos de micróglias (Rozenfeld et al., 2003). Coloração Giemsa (Sigma, EUA) e observação ao microscópio ótico serão empregados para a análise da taxa de infecção, porcentagem de células infectadas e número de parasitos por célula infectada.
Tratamento de micróglias com IFNγ, TNF, IL-10 e antagonistas: avaliaremos o efeito de citocinas nas infecções de astrócitos, os grupos serão divididos da seguinte forma: (i) micróglias tratadas com IFNɣ recombinante (eBioscience, EUA), (ii) micróglias tratados com IFNɣ e o inibidor de IFNɣ, pentoxifilina (PTX) (Sigma, EUA), (iii) micróglias tratadas com TNF recombinante (BMS301, Ebioscience, EUA) (iv) micróglias tratados com TNF e o inibidor de TNF, PTX (Sigma, EUA), (v) micróglias tratados com IL-10 (vi) micróglias tratados com IL-10 e anticorpo neutralizante monoclonal de rato anti-mouse IL-10 (clone JES052A5). Cada grupo, terá um grupo controle homologo sem adição de tratamento, para verificação da taxa de infecção. As citocinas serão adicionadas 2 h antes da infecção e todos os bloqueadores ou antagonistas serão aplicados 30 min antes da adição das respectivas citocinas (Rozenfeld et al., 2003, Silva et al., 2015).
Tratamento de micróglias com inibidor de STAT3 e NF-kB: para avaliar a participação das vias de sinalização alvo, utilizaremos o inibidor de STAT3 nos grupos estabelecidos a partir de células da micróglia tratados com IFNɣ e o inibidor de NF-κB -TPCK nos grupos tratados com TNF. Todos os grupos detalhados anteriormente, serão submetidos à inibição das vias, para intentar compreender o papel desempenhado como facilitador da persistência do parasito dentro da micróglia.
Avaliação da viabilidade celular por MTT: será quantificada a viabilidade mitocondrial e a viabilidade celular dos astrócitos pela redução do MTT (3-(4,5-dimetiltiazoil-2-il)-2,5-difenil tetrazólio brometo) leitura em espectrofotômetro (490nm).
Estudo da expressão de moléculas alvo do estudo por Western blotting: será realizada como descrito no modelo in vivo.
Dosagem de citocinas em sobrenadantes de cultivos de micróglias: serão avaliadas citocinas de perfil Th1/Th2/Th17 (TNF, IFNɣ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A), utilizando kit BD CBA Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit, segundo as indicações do fabricante.
Análise Estatística: Para avaliar a normalidade dos dados utilizaremos o teste Shapiro-Wilks. Para determinar se houve diferenças estatísticas significativas entre os grupos infectados em comparação com os grupos controle, aplicaremos o teste t-Student com nível de confiança de 95% para dados com distribuição normal e o teste de Mann Whitney para dados não parametricos ou ANOVA, quando aplicável. Correlações serão avaliadas pelo coeficiente de correlação de Pearson. Os testes estatísticos serão realizados no GraphPad Prism versão 8.0. As diferenças serão consideradas estatisticamente significativas quando p < 0,05. Os dados serão expressos como aritméticas e desvios-padrão.

Indicadores e metas:
1. Investigar se a infecção crônica cronificação da infecção pelo T. gondii induz a redução do volume de matéria cinzenta, atrofia cerebral e alterações na morfologia neuronal, em modelo murino de infecção crônica.
Meta:
1.1. Avaliar o impacto da cronificação da infecção pelo T. gondii na modificação estrutura cerebral de camundongos C57BL/6 experimentalmente infectados, através de imuno-histoquímica (IHS).
1.2. Identificar áreas específicas do SNC com sinais de redução do volume da matéria cinzenta nos animais infectados, através de IHS.
1.3. Determinar a existência de alterações morfológicas na estrutura dos neurônios de animais infectados, através de histologia.
1.4. Determinar a existência de correlação entre a redução de volume da matéria cinzenta, atrofia cerebral, alteração morfológica dos neurônios e alterações comportamentais previamente avaliadas em este grupo de animais infectados.


2. Avaliar o perfil de citocinas pró-inflamatórias no SNC ao longo da cronificação da infecção por T. gondii.
Meta:
2.1. Medir os níveis expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias intracerebrais, como IFNɣ, TNF, IL-10, em diferentes estágios da infecção crónica de murinos infectados pelo T. gondii (30, 60 e 90 dias após a infecção).
2.2. Estabelecer o perfil de expressão dessas citocinas intracerebrais, ao longo da cronificação da infecção em comparação com os controles.

3. Avaliar a participação da sinalização por STAT3 e NF-ҡB como possíveis vias pelas quais as citocinas IFNγ, TNF e Il-10 favoreceriam a persistência do T. gondii na micróglia.
Meta:
3.1. Avaliar a expressão das vias de sinalização STAT3 e NF-ҡB nos cérebros dos camundongos C57BL/6 infectados cronicamente pelo T. gondii.
3.2. Correlacionar a expressão dos alvos supracitados, com a expressão de citocinas proinflamatórias intracerebrais e carga parasitaria intracerebral.

4. Investigar o papel do IFNɣ, TNF e IL-10 na persistência de T. gondii, in vitro em células do SNC.
Meta:
4.1. Tratar ou estimular micróglias in vitro, utilizando cultura de células microglial murina imortalizada Bv-2, com as citocinas proinflamatorias e seus respectivos inibidores, para determinar o efeito destas na persistência do T. gondii dentro da célula, com pelo menos 3 repetições para cada condição.
4.2. Demonstrar uma redução ou aumento na persistência de T. gondii em presença de citocinas específicas, ou seus inibidores em comparação com os controles.

5. Avaliar a participação da sinalização por STAT3, NF-ҡB in vitro como possíveis vias pelas quais as citocinas IFNγ, TNF e IL-10 favoreceriam a persistência do T. gondii em células da glia (micróglias).
Meta:
5.1. Quantificar a ativação das vias STAT3 e NF-ҡB das culturas de micróglia in vitro, através de Western blotting.

e) Resultados e impactos esperados
Resultados
Este projeto busca elucidar os mecanismos moleculares e biológicos pelos quais a infecção pelo Toxoplasma gondii contribui para o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas e transtornos mentais. Dada a prevalência global do parasito e sua capacidade de persistir no SNC, compreender essas interações é crucial. Espera-se que os resultados revelem novos mecanismos biológicos e moleculares pelos quais a infecção pelo T. gondii induz alterações comportamentais e cognitivas. Assim, esperamos que os achados proporcionem uma nova perspectiva sobre a etiologia de doenças neurológicas e psiquiátricas, desafiando a compreensão atual e sugerindo que fatores infecciosos crônicos, muitas vezes negligenciados, desempenham um papel mais significativo do que se pensa.
Adicionalmente, esperamos produzir uma dissertação de mestrado, um trabalho de TCC e dois artigos publicados em revistas indexadas, a partir dos resultados de este projeto.
Impactos esperados
Em uma sociedade onde se faz importante e imprescindível cuidar da saúde mental, este tipo de projeto ganha relevância, pois aborda diretamente as complexidades associadas às doenças neurológicas e transtornos mentais, condições que afetam milhões de indivíduos ao redor do mundo. Ao investigar a relação entre infecções parasitarias crônicas, como a causada pelo Toxoplasma gondii, e o desenvolvimento de alterações neurodegenerativas e comportamentais, este estudo promete ampliar nossa compreensão sobre os mecanismos subjacentes a estas condições. Além a proposta tem potencial para revelar novos alvos para intervenções terapêuticas, que atuem contra a persistência do parasito e consequentemente diminua sinais neurológicas e a gravidade da doença em pacientes afetados, especialmente imunocomprometidos, focadas na modulação da resposta imune e na inibição das vias de sinalização envolvidas na persistência de infecções crônicas no SNC. Assim mesmo, os resultados podem levar a uma maior conscientização sobre a importância de considerar a saúde mental dos pacientes como parte integral do atendimento nos casos de doenças infecciosas, contribuindo assim para o bem-estar geral da população e para a construção de comunidades mais resilientes e informadas sobre os desafios associados às doenças mentais e neurológicas.