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O arroz é consumido por grande parte da população mundial, sendo alimento básico principalmente para pessoas em vulnerabilidade social. No Brasil o arroz representa um papel significativo, tanto em termos de produção quando de consumo. Dessa forma, a produção de arroz está ligada à segurança alimentar global, além de representar crescimento econômico e emprego. No entanto, a produtividade e a produção total do arroz atingiram um platô, enquanto que a população segue aumentando. Além disso, a ocorrência de estresses abióticos, cada vez mais frequentes devido as mudanças climáticas, afetam drasticamente o rendimento de arroz. No Rio Grande do Sul, principal estado produtor de arroz do Brasil, assim como em diferentes regiões do mundo, a cultura experimenta os efeitos de estresses como seca, que ocasiona falta de água para irrigação; salinidade; baixas temperaturas e toxidez por ferro. Portanto, uma das estratégias para lidar com esse cenário é o desenvolvimento de novas cultivares de arroz, mais produtivas e tolerantes a estresses abióticos. Estudar os mecanismos moleculares envolvidos com a produtividade e tolerância a estresses abióticos, assim como as alterações fenotípicas sob essas condições, pode auxiliar os melhoristas no desenvolvimento de genótipos superiores. Diferentes genes envolvidos na tolerância a estresses abióticos, como também na produtividade, já foram identificados em arroz. No entanto, há muitas lacunas que ainda precisam ser preenchidas. Além disso, a identificação dos mecanismos moleculares com base no germoplasma brasileiro vai gerar informações mais precisas e efetivas para aplicação prática nos programas de melhoramento, que usam a base genética local. Por isso, esse estudo propõe o uso de diferentes ferramentas integradas para identificar mecanismos moleculares envolvidos na produtividade e na tolerância a estresses abióticos em cultivares de arroz utilizadas no Brasil. As informações científicas geradas podem contribuir com o desafio de atender a demanda futura de alimentos e lidar com os efeitos das mudanças climáticas.

ESTUDO I - Mapeamento associativo para componentes de rendimento, produtividade e tolerância a estresses abióticos em arroz

Genotipagem
Uma coleção de 188 genótipos de arroz usados no Brasil já foi genotipada no Laboratório de Serviços de Genotipagem do IRRI (International Rice Research Institute) usando a plataforma 7K Infinium SNP genotyping platform (Illumina®) (versão adaptada do 6 K Infinium array) (Thomson et al. 2017), com 7098 marcadores SNP.
Os dados de genotipagem passaram por duas filtragens. A primeira filtragem foi feita no programa TASSEL V.5.2.41 (Bradbury et al. 2007) e restaram 177 genótipos e 4843 marcadores. A segunda filtragem, baseada na queda do desequilíbrio de ligação (LD decay), foi executada no programa pLINK (Purcell et al. 2007), resultando em 1185 marcadores, que serão utilizados para construção da matriz de parentesco, estrutura da população e análise de GWAS (genome-wide association study) para diferentes características de importância agronômica.
Para construção da matriz de parentesco os marcadores restantes das duas filtragens serão transformados em marcadores codominantes (dados bi-alélicos). Os valores transformados serão utilizados para obtenção da matriz de parentesco de acordo com o modelo Queller-Goodnight (Queller, Goodnight 1989) no programa Coancestry (Wang, 2011). A matriz de parentesco será utilizada no momento da transformação dos dados fenotípicos em BLUPs (Best Linear Unbiased Prediction).
A estrutura da população será obtida utilizando o método de agrupamento Bayesiano, aplicado no software Structure versão 2.3.4 (Pritchard et al. 2000). Serão testados os melhores modelos contendo de 1 até 10 subpopulações, de k=1 (uma população) a k=10 (dez subpopulações). As análises geradas pelo programa Structure serão avaliadas no portal/site StructureSelector (Li e Liu, 2018) e para identificar o melhor valor de k (número de subpopulações) será utilizado o método Delta k (Evanno et al. 2005).

Experimento I
A coleção de 177 genótipos de arroz será cultivada no campo da Embrapa Clima Temperado, estação experimental Terras Baixas, localizado em Capão do Leão, Rio Grande do Sul, Brasil. O cultivo será feito utilizando sistema irrigado por inundação, e os tratos culturais e fitossanitários serão feitos de acordo com as recomendações técnicas para o cultivo do arroz no Sul do Brasil (SOSBAI, 2022).
O desenho experimental será de blocos ao acaso, com três repetições. Cada genótipo será semeado em linhas de 1,0 m de comprimento, com espaçamento 0,20 m, e densidade de semeadura de 45 sementes por metro linear.
Serão avaliadas diferentes características de importância agronômica, como altura de planta, comprimento da panícula, número de panícula por planta, número de grãos na panícula principal, número de grãos cheios na panícula principal e a produtividade por planta.

Experimento II
A coleção de 177 genótipos de arroz será semeada em bandejas, contendo solo de área utilizada para cultivo de arroz irrigado. O experimento será conduzido em casa de vegetação pertencente ao Centro de Genômica e Fitomelhoramento da Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel da Universidade Federal de Pelotas, localizada no Município de Capão do Leão, RS.
Em cada bandeja serão semeadas 10 linhas com 15 sementes cada, sendo que cada linha vai corresponder a um genótipo. As testemunhas serão semeadas ao acaso em cada repetição. Será utilizado o delineamento de blocos ao acaso, com três repetições.
O manejo será feito de acordo as recomendações técnicas para a cultura (SOSBAI, 2022). Quando as plantas estiverem em V4 a lâmina d’água será drenada e substituída por lâmina com solução salina a uma concentração de 120mM NaCl (Singh et al. 2021). O estresse será mantido durante 7 dias (Liu et al. 2017), e após esse período serão feitas as diferentes avaliações morfológicas (comprimento da parte aérea, comprimento da raiz, massa seca da parte aérea e massa seca da raiz).

Experimento III
Cada genótipo da coleção (177 genótipos) será semeado em copos com capacidade de 750 mL, contendo substrato. O experimento será conduzido em sala de crescimento com controle de luz e temperatura, pertencente ao Centro de Genômica e Fitomelhoramento da Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel da Universidade Federal de Pelotas, localizada no Município de Capão do Leão, RS. Será utilizado o delineamento de blocos casualizados, com três repetições.
Será fornecido umidade ao solo até o momento da germinação e emergência das plântulas. Posteriormente, as plântulas passarão por estresse por déficit hídrico durante 20 dias, quando será feita análise de diferentes parâmetros morfológicos (comprimento da parte aérea, comprimento da raiz, massa seca da parte aérea e massa seca da raiz).

Experimento IV
Cada genótipo da coleção (177 genótipos) será semeado em papel germiteste. Sete dias após a semeadura as plântulas serão submetidas ao estresse por baixas temperaturas (13°C) durante 7 dias. O experimento será conduzido em sala de crescimento com controle de luz e temperatura, pertencente ao Centro de Genômica e Fitomelhoramento da Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel da Universidade Federal de Pelotas, localizada no Município de Capão do Leão, RS. Será utilizado delineamento de blocos casualizados, com três repetições. Após o período de estresse será feita análise de diferentes parâmetros morfológicos (comprimento da parte aérea, comprimento da raiz, massa seca da parte aérea e massa seca da raiz).

Análise de dados de fenotipagem
Os dados de fenotipagem (diferentes variáveis, obtidas em diferentes condições ambientais) serão testados quanto à normalidade utilizando o procedimento “proc univariate”. Posteriormente, será identificado o tipo de distribuição (exp, gamma, igauss, logn) utilizando o procedimento “proc severity”. Em seguida, será feita análise de variância usando modelos lineares mistos generalizados – GLM (generalized linear mixed model), através do procedimento “proc glimmix”. As análises serão feitas usando o programa SAS Studio.

Obtenção de BLUPs (Best Linear Unbiased Prediction)
Os dados de fenotipagem serão transformados em BLUPs levando em consideração o tipo de distribuição e a matriz de parentesco de Queller-Goodnight. Para obtenção dos BLUPs será utilizado o procedimento “proc glimmix” no programa SAS Studio.

Mapeamento associativo – GWAS – genome-wide association study
A análise de mapeamento associativo será feita no programa TASSEL V.5.2.41 utilizado o método GLM (general linear model), o qual inclui os dados fenotípicos, os dados genotípicos (1185 locos SNPs) e a estrutura da população – Q (Principal Componente Analysis – PCA ou estrutura da população construída pelo programa STRUCTURE). Para considerar um loco SNP associado as diferenças fenotípicas das diferentes variáveis será estabelecido como ponto de corte valores a partir da correção de Bonferroni (-log10 P-Value = 0,05 / nº SNPs) (Gonzalo et al. 2022), que neste estudo será igual a 4.37. Os resultados serão apresentados em Manhattan plot.

Identificação de genes
Os bancos de dados Rice Genome Annotation Project (http://rice.uga.edu/) e Rice Annotation Project data base (http://rapdb.dna.affrc.go.jp/) serão utilizados para dissecação das regiões cromossômicas que apresentam SNPs associados com as características de interesse. Para identificar genes candidatos ligados aos SNPs significativos, a localização física de cada marcador em cada cromossomo será identificada. A partir dessa posição, uma região de 10kb de cada lado SNP será analisada.

ESTUDO II – Análise de expressão gênica em plantas de arroz submetidas a toxidez por Fe
O grupo de pesquisa dispõe de dados de transcriptoma de plantas de arroz submetidas ao estresse por toxidez por Fe no início do estádio vegetativo. Esse experimento foi conduzido com cultivares desenvolvidas no Brasil e que apresentam resposta contrastante para o estresse. Os dados do transcriptoma sob toxidez por Fe foram pouco explorados e devem ser reanalisados (bioinformática e estatística) para identificação de genes candidatos para tolerância a esse estresse.

Metas:
Identificar genes envolvidos na produtividade de genótipos de arroz utilizados no Brasil até dezembro de 2024.
Identificar genes envolvidos na tolerância à salinidade de genótipos de arroz utilizados no Brasil até dezembro de 2026.
Identificar genes envolvidos na tolerância à toxidez por ferro em genótipos de arroz utilizados no Brasil até dezembro de 2026.
Identificar genes envolvidos na tolerância a baixas temperaturas em arroz até dezembro de 2026.
Identificar genes envolvidos na tolerância à seca em genótipos de arroz utilizados no Brasil até dezembro de 2026.
Resultados Esperados:
Com a execução dessa proposta espera-se identificar genes envolvidos na produtividade e tolerância a seca, salinidade, toxidez por Fe e baixas temperaturas em arroz. Os genes identificados poderão ser utilizados/manipulados por melhoristas para desenvolver cultivares de arroz mais produtivas e com maior tolerância a estresses abióticos. A identificação dos mecanismos moleculares com base no germoplasma brasileiro vai gerar informações mais precisas e efetivas para aplicação prática nos programas de melhoramento, que usam a base genética local. Por fim, os genótipos com maior tolerância a estresses poderão ser indicados para cultivo em áreas que enfrentam essas condições adversas durante a safra de cultivo ou utilizados em blocos de cruzamentos visando o desenvolvimento de novas cultivares.
Além dos resultados de cunho científico e tecnológico, espera-se a formação de recursos humanos, com a qualificação de estudantes de graduação (iniciação científica, trabalhos de conclusão de curso-TCC), pós-graduação (mestrado e doutorado) e de pós-doutorado.