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A menopausa é um processo biológico natural que ocorre na vida da mulher, caracterizada pela ausência da menstruação por doze meses, devido à perda da reserva folicular ovariana ou à retirada cirúrgica dos ovários. De forma natural a menopausa normalmente ocorre entre os 45 - 55 anos de idade (te Velde et al., 1998). A transição do período reprodutivo para a pós menopausa, denominada perimenopausa, ocorre ao longo de vários anos e é caracterizada por mudanças fisiológicas e comportamentais (Tinelli et al., 2002). Os sintomas da menopausa incluem alterações metabólicas, de peso, da microbiota intestinal, disfunção sexual e distúrbios relacionados ao sistema nervoso central (Mosconi et al. 2021).
A transição para a menopausa afeta as trajetórias de envelhecimento de múltiplos sistemas e órgãos, incluindo o cérebro. Alguns pesquisadores, descrevem que a menopausa não é apenas um estado de transição reprodutiva, mas também de transição neurológica, já que muitos dos sintomas, como alterações de humor, ondas de calor, insônia e esquecimento são de natureza neurológica (Maki et al., 2022). O declínio do nível de hormônios sexuais tem grandes efeitos no metabolismo e no estado imunológico do cérebro em roedores e humanos, conforme descrito por (Yin et al., 2015; Mosconi et al., 2021). Além disso, mudanças na composição da microbiota intestinal, chamada de disbiose, foi apontada como uma das principais contribuintes para doenças como obesidade, diabetes tipo 2 e doenças neuropsiquiátricas (Thursby et al., 2017). Sendo os níveis de estrogênio entre um dos fatores que podem afetar a composição da microbiota intestinal (Yang et al., 2022; Thursby et al., 2017), porém ainda não suficientemente investigado. No entanto, evidências recentes, têm mostrado que os níveis de estrogênio podem regular a secreção de Beta-glucuronidase, que é uma enzima que atua na desconjugação do estrogênio, permitindo que ele volte a sua forma ativa, sendo capaz de se ligar aos seus receptores e exercer suas funções fisiológicas (Baker et al., 2017; Yang et al., 2022). As bactérias do gênero Firmicutes e Bacteroidetes são responsáveis pela produção de beta-glucuronidase (Baker et al., 2017). Portanto, fica evidente a relação direta entre ocorrência de menopausa, níveis estrogênicos com sintomas intestinais/neurológicos.
A propósito, as doenças crônicas não transmissíveis representam a principal causa de morte no mundo (Malta et al., 2014). No Brasil, esse número chega a 70 % e as doenças cardiovasculares representam 28% das mortes (Malta et al., 2014). O processo de envelhecimento pode ser causado por acúmulo de dano celular, encurtamento dos telômeros, instabilidade genômica e diminuição das proteases. Como resposta a esses danos, o organismo inicia uma série de adaptações antagonísticas como a desregulação a sensibilidade a nutrientes, disfunção mitocondrial e senescência celular (Lopez-Otin et al., 2013). Desta maneira, a presença de doenças crônicas como diabetes tipo 2, doenças cardiovasculares, câncer e outros aumenta dramaticamente com o aumento da idade da população, tornando-se um problema econômico grave em diversos países. No entanto, na mulher este processo é agravado com o inicio da menopausa, a diminuição da produção de estrogênio pelos ovários é um fator de risco para o surgimento dessas doenças crônicas (Carr et al., 2003). Essas deficiências hormonais levam a alterações na sensibilidade à insulina, no perfil lipídico sérico e na distribuição de gordura (Stevenson et al., 1993; Kim et al., 2000). A ocorrência de doença cardiovascular em mulheres na pré-menopausa é menor do que em homens da mesma idade, porém aumenta nas mulheres na pós-menopausa a níveis comparáveis aos homens. (Carr et al., 2003; Wellons et al., 2012; Sutton-Tyrrel et al., 1998). Neste sentido, a síndrome metabólica é caracterizada pelo aumento da adiposidade central, resistência à insulina e dislipidemia. Em mulheres pós-menopausa, há um aumento na incidência de síndrome metabólica que é um preditor de ocorrência de doenças cardiovasculares (Carr et al., 2003). Portanto, é importante compreender as alterações fisiológicas e bioquímicas associadas à menopausa para prevenir a incidência de doenças crônicas neste grupo de alto risco. A melhor compreensão de marcadores séricos de doenças crônicas poderão ajudar na tomada de decisão no momento de início de novas terapias preventivas e risco de doenças.
Da mesma maneira que os marcadores bioquímicos refletem parâmetros de saúde, os microRNAs (miRNAs) também estão presentes no sangue e podem auxiliar no prognóstico de diversas doenças (Volinia et al., 2006). Os microRNAs são pequenos RNAs não codificantes (cerca de 22 nucleotídeos) capazes de regular a estabilidade do mRNA, exercendo um papel regulador do metabolismo (Bartel et al., 2004). Os miRNAs são conhecidos por seu papel no crescimento e proliferação celular, regulando vias que são críticas para processos de envelhecimento celular (Volinia et al., 2006). Estes microRNAs apesar de intracelulares, podem ser excretados pelas células e encontrados na circulação como marcadores de diversas condições patológicas, incluindo o câncer e desordens metabólicas (Chen et al., 2012; Cortez et al., 2011).
Apesar destas evidências, pouco é sabido sobre o perfil de miRNA associado ao envelhecimento ovariano e menopausa. Alguns estudos indicam que certos miRNAs são expressos diferencialmente nos ovários de mulheres durante o envelhecimento (Moreno et al., 2015; Diez-Fraile et al., 2015). Nossos dados em camundongos também mostram uma série de miRNAs diferentemente regulados durante o envelhecimento no ovário (Schneider et al., 2017). Ainda um perfil sérico especifico de miRNAs foi associado a ocorrência de osteoporose em mulheres pós-menopausa (Shao et al., 2020). Assim torna-se importante identificar quais miRNAs estão associados ao envelhecimento ovariano e, são reguladores dos processos de desenvolvimento de doenças crônicas nas mulheres em transição para a menopausa. Como está este perfil no momento de transição da fase pré para pós-menopausa? Este perfil é indicativo de desenvolvimento de síndrome metabólica no período pós-menopausa? Pode ser um indicador da necessidade do uso de terapia de reposição hormonal? Assim é necessário observar se quais destes miRNAs são regulados na circulação em mulheres na transição e no período pós-menopausa e podem ser preditores de condições comuns neste período como dislipidemia, resistência a insulina, obesidade, entre outras condições característica desta fase da vida nas mulheres.
Além dos miRNAs e marcadores bioquímicos, é sabido que os níveis do hormônio anti-mulleriano (AMH) é indicador do declínio ovariano (Visser et al., 2006). Consequentemente, pode ser um marcador de infertilidade e relacionado com o processo de saúde da mulher na pós-menopausa em conjunto com outros marcadores. Apesar do AMH não estar relacionado diretamente com a idade da mulher ele sofre muita variabilidade entre individuos e etnias diferentes e a sua diminuição está fortemente associado com o período da pós-menopausa (Alexander et al., 2021). Desta maneira se torna um importante marcador da função ovariana e saúde feminina junto com outros parâmetros metabólicos.
Com o aumento da expectativa de vida, mais mulheres passam uma parte significativa da sua vida no período pós-menopausa e, portanto, haverá um aumento na incidência de distúrbios metabólicos e de saúde mental. Desta maneira a identificação de marcadores do estado de menopausa e risco de doenças crônicas pode resultar na redução de complicações de saúde em mulheres pós-menopausa permitindo intervenções precoces e direcionadas em futuros estudos.

DELINEAMENTO DO ESTUDO/AMOSTRA
O delineamento do estudo será do tipo Coorte prospectivo, randomizado duplo cego.
A amostra será composta por todas as mulheres atendidas no Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Escola da Universidade Federal de Pelotas e recrutadas através de contato pessoal e através das redes sociais com idade entre 18 e 60 anos, que aceitarem participar da pesquisa e que assinarem o termo de consentimento.
As mulheres identificadas como na fase da perimenopausa serão recrutadas para retorno anual por 5 anos após a primeira coleta para que sejam efetuadas novas coletas de sangue para acompanhamento da evolução dos parâmetros bioquímicos e estado nutricional.

TAMANHO DA AMOSTRA
A população alvo são mulheres pré, peri e pós-menopausa. Serão incluídas no estudo mulheres entre 18 e 60 anos. As mulheres serão classificadas de acordo com o ciclo menstrual. Para que seja caracterizada a menopausa, a mulher deve ter parado de menstruar há pelo menos 12 meses. Mulheres com mais de 45 anos e ciclos irregulares há menos de 12 meses serão consideradas como peri-menopausa. Para as mulheres pré e pós-menopausa serão identificadas e divididas entre aquelas que apresentem característica de síndrome metabólica (circunferência da cintura > 88 cm; triglicerídeos ≥ 150 mg/dl; HDL Colesterol < 50 mg/dl; glicemia de jejum ≥ 110 mg/dl) e controles saudáveis. Desta forma, o poder da amostra será calculado conforme indicado abaixo.
O cálculo do tamanho da amostra partiu da revisão de literatura e foi realizado no programa aberto online de estatísticas epidemiológicas OpenEpi - Open Source Epidemiologic Statistics for Public Health, versão 3. Considerou-se um nível de confiança de 95% e o cálculo amostral foi realizado para os níveis de miRNAs marcadores de menopausa, conforme dados fornecidos pela revisão, por diferença de média entre os grupos. Espera-se que um bom marcador tenha uma expressão 50% maior ou menor que o respectivo grupo controle. Desta maneira obtemos um n necessário de 16 participantes por grupo. Além disso, foram acrescentados 10% para eventuais perdas, totalizando 18 pacientes por grupo. Assim nosso objetivo será coletar amostras de 36 mulheres pré-menopausa (18 com síndrome metabólica e 18 sem síndrome metabólica), 36 mulheres peri-menopausa (18 com síndrome metabólica e 18 sem síndrome metabólica) e 36 mulheres pós-menopausa (18 com síndrome metabólica e 18 sem síndrome metabólica). Desta forma precisamos de um grupo de 108 mulheres, destas 54 com síndrome metabólica. Considerando uma incidência estimada de síndrome metabólica de 25% (Penalva et al, 2008), precisaremos coletar amostras de 216 mulheres esperando a incidência da condição em ao menos 54 mulheres.

CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO
Serão incluídos no estudo mulheres com idade ≥18 e ≤60 anos, atendidas no Laboratório de Análises Clinicas do Hospital Escola da Universidade Federal de Pelotas e recrutadas através de contato pessoal e através das redes sociais durante os meses de novembro de 2023 e dezembro de 2024, que aceitem participar do estudo mediante preenchimento do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE).
Serão excluídas do estudo mulheres grávidas, que estão amamentando, em tratamento para o câncer, que tenham passado por quimioterapia em algum momento da vida e que tenham sofrido ooforectomia.

LOGÍSTICA E CARACTERIZAÇÃO DO LOCAL
Recrutamento inicial
O Laboratório de Análises Clinicas do Hospital Escola da Universidade Federal de Pelotas oferece o serviço de realização de exames bioquímicos à comunidade de Pelotas. Desta forma, todos aqueles pacientes que têm a requisição médica, de diferentes especialidades, primeiramente realizam o agendamento para a coleta de sangue. Além disso, serão incluídas no estudo mulheres recrutadas através de contato pessoal e através das redes sociais.
O primeiro contato com as mulheres recrutadas ao estudo será feito no Laboratório de Análises Clinicas, durante o agendamento para a realização do exame de sangue ou através das redes . As mesmas serão convidadas a participar do estudo de forma voluntária e receberão o termo de consentimento para assinar. Após, ocorrerá aplicação do questionário, aferição do peso, estatura, circunferência da cintura e será entregue um frasco para coleta de fezes, o qual deverá ser devolvido no laboratório no dia da realização do exame. Quanto à coleta de sangue, esta será realizada no mesmo momento da coleta de sangue que já está agendada. Durante a coleta de sangue dos exames requisitados será coletado um tubo extra de sangue (5 mL) para uso nesta pesquisa, para posterior processamento e análises de parâmetros bioquímicos e miRNAs. Por isso, diariamente, durante o período da coleta de dados, uma das entrevistadoras irá recolher no laboratório as amostras de sangue e fezes, as quais serão levadas até o laboratório do Centro de Pesquisas da Universidade Federal de Pelotas, para o processamento e armazenamento em freezer -80o C.
Para as mulheres recrutadas de maneira pessoal ou online, procedimento similar será adotado. As mulheres serão convidadas a comparecer na Faculdade de Nutrição da UFPel em dias específicos previamente agendados onde serão recebidas pela equipe do projeto. Após assinar o termo de consentimento ocorrerá aplicação dos questionários, aferição do peso, estatura, circunferência da cintura. A coleta de sangue em um tubo de sangue (5 mL) será realizada após a entrevista por uma técnica treinada.

Retorno para novas avaliações
Para aquelas mulheres identificadas como em perimenopausa será feito o contato anualmente, por um período de 5 anos após a coleta inicial, para convidar para nova coleta de sangue e avaliação nutricional. Para isso será requisitado o contato telefônico das mulheres no momento da primeira entrevista. Aquelas que concordarem serão atendidas no Centro de Pesquisas do Hospital Escola onde serão submetidas aos mesmos procedimentos descritos para a coleta inicial após assinatura de novo TCLE. Neste momento haverá uma técnica em laboratório no local que será responsável pela coleta de sangue. Será feito uma divulgação online e contato pelo WhatsApp e telefone para agendar a data da coleta anual. A equipe ficará disponível durante o período de uma semana todos os dias das 7:00 as 10:00 hs em sala específica no Centro de Pesquisa. Não haverá coleta de fezes nas entrevistas de retorno, somente na coleta inicial do estudo. As pacientes poderão ser chamadas e participar para a coleta de retorno no ano 2, mesmo que não tenham comparecido no ano 1 e assim, respectivamente.

INSTRUMENTOS
Medidas Antropométricas
As medidas serão coletadas por nutricionistas treinadas, sempre usando os mesmos equipamentos e registradas em formulário de acompanhamento individual da pesquisa.
● Peso: será aferido no momento da aplicação do questionário utilizando balança digital, com capacidade para 200kg. Os pacientes serão pesados usando roupas leves, descalços, com os braços caídos ao longo do corpo e olhando para frente.
● Altura: será aferida no momento da aplicação do questionário utilizando estadiômetro. Os pacientes serão medidos descalços, posicionados no plano de Frankfurt.
● Circunferência da cintura: será aferida em centímetros, na região mais estreita do abdômen ou no ponto médio entre o rebordo costal inferior e a crista ilíaca, utilizando uma fita métrica flexível posicionada em plano horizontal.
● IMC: A partir das medidas de peso e estatura será feito o cálculo do IMC, sendo adotadas classificações para adultos.

Marcadores Bioquímicos
A coleta de sangue será realizada pelo técnico em análises clínicas do Laboratório do Hospital Escola, por agendamento prévio, na qual o paciente deverá estar em jejum de pelo menos 8 horas. No caso das mulheres recrutadas fora do Hospital Escola a coleta de sangue será realizada também após jejum de no mínimo 8 horas em sala especifica na Faculdade de Nutrição do Campus Anglo por uma técnica treinada. O sangue coletado será armazenado em frasco extra com capacidade de 5 ml, tampa vermelha ou amarela com gel separador com EDTA, devidamente etiquetado com o nome do paciente, idade, data e hora da coleta. Esse tubo, ficará refrigerado sob uma temperatura de 4° a 8°C, por no máximo 4 horas, quando será transportado, dentro de uma caixa térmica com controle de termômetro externo, em posição vertical, a fim de evitar o derramamento da amostra, até o laboratório de Centro de Pesquisas Clínicas da UFPEL, onde será processado.
O soro será separado por meio da centrifugação do sangue por 10 minutos a 1.500 x g. O tubo será retirado da centrífuga, com o uso de uma pipeta o soro será aspirado e transferido para um novo tubo, o qual será congelado a -80°C para posterior analises de bioquímica e de microRNAs.
Os parâmetros bioquímicos/hormonais a serem analisados em analisador automático usando kits comerciais são:
● Metabolismo lipídico: Triglicerídeos, colesterol total e suas frações.
● Metabolismo glicídico: Glicemia de jejum, Hemoglobina Glicada.
● Enzimas hepáticas: Gama glutamil transferase (GGT), Transaminase oxalacética (AST) e Transaminase pirúvica (ALT)
● Hormonal: anti-mulleriano (AMH)

Medição dos miRNAs
A mensuração dos miRNAs será feita inicialmente a partir de sequenciamento e quantificação dos miRNAs sanguíneos. Esta técnica de varredura será aplicada em um numero menor de amostras do estudo devido a seu alto custo. Após a identificação inicial dos miRNAs alvo especificamente regulados neste pequeno grupo será feita a validação por técnica de baixo custo em larga escala no total das amostras coletadas. Para isso será extraído o RNA total do soro sanguíneo usando a metodologia do Trizol. A partir desse RNA total serão preparadas bibliotecas de miRNAs usando kit comerciais (NEXTFLEX® Small RNA Sequencing Kit V4).

I. Identificação de biomarcadores a base de miRNAs para menopausa e síndrome metabólica
II. Redução de custo com tratamento de doenças crônicas bem como de complicações do uso de terapia de reposição hormonal com estrógenos.
O produto proposto terá um impacto positivo para a saúde pois visa diminuir a incidência de doenças crônicas como as DCVs em mulheres pós-menopausa. Com o aumento da expectativa de vida, mais mulheres passam uma parte significativa da sua vida no período pós-menopausa e, portanto, representam um grupo crescente em nossa sociedade que irá ter considerado aumento na incidência de doenças crônicas se medidas preventivas mais eficazes não forem tomadas. Em segundo lugar o produto proposto irá auxiliar na tomada de decisão de uso ou não das atuais terapias de reposição hormonal existente no mercado. Desta maneira reduzindo o custo econômico com o tratamento e mortalidade por efeitos colaterais das atuais terapias como o tromboembolismo.