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O arroz (Oryza sativa L.) é uma das culturas mais importantes do mundo, contribuindo com 20% da energia alimentar global. Além disso, por ser de fácil acesso em termos econômicos, o arroz é o principal alimento para pessoas pobres e subnutridas. Dessa forma, este cereal é uma das comodities ligada à segurança alimentar, além de representar crescimento econômico, emprego, estabilidade social e paz regional (Bin Rahman e Zhang, 2023). No Brasil o arroz é um dos principais componentes da dieta, sendo consumido por toda população, independentemente do nível socioeconômico (Toledo et al. 2022). O Brasil é o nono maior produtor de arroz do mundo, sendo o principal produtor fora do continente asiático. Na safra 2022/2023 o País produziu 10,03 milhões de toneladas de arroz, em uma área 1,47 milhões de ha, com uma produtividade de 6.781 kg ha-1. O Rio Grande do Sul é responsável pela maior parte da produção de arroz do Brasil, contribuindo com 6,9 milhões de toneladas, cultivados em uma área de 862,6 mil ha e com produtividade de 8.039 kg ha-1 (CONAB 2024). No Estado o cultivo é feito empregando o sistema irrigado por inundação. Nessa região, a cultura é impactada por diferentes condições ambientais adversas, incluindo toxidez por ferro (Maltzahn et al. 2020), salinidade (Oliveira et al. 2022), baixas temperaturas (Viana et al. 2021), secas prolongadas que restringem a disponibilidade de água para irrigação (Tejeda et al. 2024) e, mais recentemente, altas temperaturas (Marschalek et al. 2023).
Em um cenário de mudanças climáticas, o aumento da temperatura global já é uma realidade, e prevê-se que episódios curtos de estresse térmico aumentarão em frequência e intensidade, podendo atingir 120 milhões de hectares cultivados com arroz. O aumento da temperatura média global causará perdas significativas na produtividade desse cereal (Mahmood et al. 2022).
A sensibilidade do arroz ao estresse por alta temperatura varia de acordo com o estádio de desenvolvimento. O reprodutivo/florescimento, que compreende o emborrachamento (gametogênese), antese e fertilização, é a fase mais sensível ao estresse térmico. No estádio reprodutivo a temperatura crítica está entre 33,7ºC (antese) a 35ºC (demais estádios de florescimento) (Salgotra e Chauhan, 2023).
Quando o estresse ocorre na microsporogênese, na fase de micrósporo (grão de pólen imaturo), resulta em anormalidade das anteras, com redução da viabilidade do pólen e aumento da esterilidade das espiguetas. A redução da viabilidade do pólen é decorrente da interrupção da meiose, degeneração das células do tapete, alteração do metabolismo de carboidratos e danos oxidativos. Similarmente, estresse por calor na megasporogênese provoca alterações anatômicas e fisiológicas no pistilo, além alterar o metabolismo, levando a maior esterilidade das espiguetas (Xu et al. 2021; Shi et al. 2022).
Na antese o estresse por calor provoca alteração no formato da antera, diminuição da deiscência da antera, baixa viabilidade do pólen, redução do número de grãos de pólen no estigma, redução da germinação dos grãos de pólen no estigma, inibição do alongamento do tubo polínico e redução do comprimento do estigma. Todas essas alterações prejudicam severamente a polinização e a fertilização, reduzindo o número de espiguetas férteis. Após a dupla fertilização, a exposição ao estresse por calor por período curto afeta o desenvolvimento e estabelecimento do endosperma (Xu et al. 2021).
O genótipo influencia a sensibilidade do arroz ao estresse por calor no estádio reprodutivo. Cultivares das subespécies aus e japonica são mais sensíveis que cultivares da subespécie indica (Jagadish et al. 2010). Além disso, as espiguetas da parte superior da panícula são mais sensíveis do que as espiguetas da parte inferior, devido às diferentes temperaturas nesse órgão (Fu et al. 2016).
Nos demais estádios de desenvolvimento o arroz também pode sofrer danos ocasionados pelo estresse por calor. A elevação da temperatura por longo período reduz o potencial de germinação das sementes, resultando em baixa taxa de germinação e de vigor das plântulas. Na fase de plântula o estresse por calor pode provocar aumento da perda de água, amarelecimento das folhas, redução do crescimento das raízes, podendo levar à morte da planta. No afilhamento a temperatura elevada pode ocasionar murchamento das folhas, enrolamento e amarelecimento das folhas, redução no número de afilhos e da biomassa. Durante o enchimento de grãos o estresse por calor pode prejudicar o desenvolvimento do endosperma e do embrião, alterar o tamanho da espigueta, reduzir o peso de grãos e aumentar grãos gessados. Em relação à fisiologia da planta foi observado que, de maneira geral, o estresse por alta temperatura causa danos nas membranas, aumento do acúmulo das espécies reativas de oxigênio, danos na fotossíntese, alterações no metabolismo e partição de carboidratos, e desbalanço de fitohormônios (Xu et al. 2021).
Para responder rapidamente ao cenário de aumento de temperatura, identificar estratégias e explorar mecanismos que aumentam a tolerância ao calor são fundamentais para melhorar a tolerância a esse estresse nos estádios de desenvolvimento mais críticos do arroz. Diferentes abordagens podem ser aplicadas para melhorar a termotolerância dessa espécie, como manejo agronômico, melhoramento convencional, identificação de locos de características quantitativas, seleção assistida por marcadores e tecnologias de transgenia e edição de genomas (Xu et al. 2021). Recentemente, uma nova cultivar de arroz com maior tolerância ao calor no estádio reprodutivo, criada por melhoramento convencional, foi lançada para cultivo na região Sul do Brasil (Marschalek et al. 2023). Um estudo de caracterização de genótipos para tolerância ao calor na antese também foi conduzido. Genótipos mais termotolerantes podem ser cultivados em áreas mais propensas a esse estresse, além de serem empregados em blocos de cruzamento (Souza e Marschalek, 2022).
A tolerância ao estresse por calor no estádio reprodutivo é uma característica complexa, controlada por muitos genes, o que dificulta o processo de melhoramento (Chen et al. 2020). Portanto, desvendar a base genética e os mecanismos moleculares que controlam essa característica é crucial para auxiliar os programas de melhoramento convencional e para aplicação das estratégias de transgenia e edição de genomas. Diferentes estudos buscando elucidar como as plantas sentem o estresse, as cascatas de sinalização e as redes de regulação transcricional já foram desenvolvidos, como revisado em Xu et al. (2021). No entanto, a maioria das pesquisas com esse viés não foi feita com cultivares utilizadas no Brasil. Considerando que a resposta e a tolerância a esse estresse em arroz são dependentes do genótipo, pesquisas com cultivares locais são importantes.
Estudos de transcriptômica podem ser empregados para análise de expressão de todos os genes expressos em genótipo, condição, tecido/órgão e estádio de desenvolvimento específicos. Dentre as estratégias utilizadas na transcriptômica está o sequenciamento de RNA (RNASeq). O RNASeq foi desenvolvido há mais de uma década, e se tornou uma ferramenta indispensável na biologia molecular e tem auxiliado grandemente na compreensão da função do genoma. O RNASeq é mais frequentemente usado para analisar a expressão diferencial de genes (DEGs) (Stark et al. 2019). Essa ferramenta usa sequenciamento de ácidos nucleicos para determinar a sequência de moléculas de RNA, bem como as quantidades de RNA específicos (Deshpande et al. 2023).
Um estudo de RNASeq inicia em laboratório, com a extração de RNA, seguido da eliminação de rRNA e enriquecimento de mRNA, síntese de cDNA e preparo de biblioteca de sequenciamento através da ligação a um adaptador. A biblioteca é sequenciada com profundidade de 10 a 30 milhões de leituras por amostra, usando uma plataforma de alto rendimento. A etapa final é computacional, e envolve alinhar e montar as leituras de sequenciamento para um transcriptoma, quantificar as leituras que se sobrepõem, filtrar e normalizar as amostras, e modelagem estatística para identificar mudanças significativas nos níveis de expressão dos genes entre as diferentes amostras (Stark et al. 2019).
Um estudo de RNASeq permite a identificação de genes e mecanismos moleculares envolvidos na resposta e tolerância ao estresse por calor em estádios de desenvolvimento e genótipos específicos. A maioria dos estudos com RNASeq para tolerância ao calor em arroz foi desenvolvida no estádio de plântula e em genótipos estrangeiros (Liang et al. 2021; Wei et al. 2021, Li et al. 2022; Yang et al. 2022; Cai et al. 2023; Wang et al. 2023). Nesse sentido, a análise do transcriptoma em cultivares locais sob estresse por calor no estádio reprodutivo é uma demanda evidente para os programas de melhoramento genético no Rio Grande do Sul e no Brasil.

Experimento I – Fenotipagem e identificação de cultivares com resposta contrastante para estresse por calor
Serão avaliadas 20 cultivares de arroz, provenientes dos programas de melhoramento da Embrapa, Epagri e IRGA. Em outubro/novembro de 2024 as sementes de cada cultivar serão semeadas em seis baldes contendo solo da região de Capão do Leão. Quando as plantas atingirem o estádio V3/V4 (colar formado na terceira e quarta folha do colmo principal) vão receber lâmina de água e ureia. Todo o manejo será feito de acordo com as recomendações da cultura (SOSBAI, 2022).
O experimento será conduzido em casa de vegetação, com controle de temperatura, em delineamento de blocos ao acaso, com três repetições, cada uma composta por três plantas. Da semeadura até o final do estádio vegetativo todas as plantas permanecerão na mesma condição de temperatura, em média 25°C, mas que pode variar de acordo com o ótimo para cada estádio de desenvolvimento (SOSBAI, 2022). Ao alcançar o estádio R4 (antese), parte das plantas (três bales de cada cultivar) será transferida câmara de crescimento e submetida ao tratamento estresse por calor. Nesse caso, será utilizado 39°C de dia e 28°C de noite, durante quatro dias, com fotoperíodo de 12 horas de luz e 12 horas de escuro. Após esse período, as plantas vão retornar para condição controle até o momento da colheita. O restante das plantas (três baldes de cada cultivar) vai permanecer no tratamento controle, com temperatura próximo ao ideal para a cultura, durante todo ciclo de desenvolvimento.
A colheita será feita de forma manual e serão avaliados: número de espiguetas estéreis em cada panícula, número de espiguetas férteis em cada panícula, peso das espiguetas férteis de cada panícula, peso de mil grãos, produtividade por planta.
Os dados serão analisados quanto à distribuição, e posteriormente submetidos à análise de variância seguido do teste de agrupamento de médias Scott-Knott.

***No experimento I será aplicado estresse por calor durante quatro dias, que é o tempo indicado para screening de genótipos utilizando 39°C (Sarsu 2018; Souza Marschalek, 2022).

 
Experimento II – RNASeq em cultivares de arroz com resposta contrastante para estresse por calor
Material Vegetal
As duas cultivares de arroz mais contrastantes para tolerância ao calor no estádio reprodutivo, identificas no experimento I, serão utilizadas no experimento II para análise de transcriptômica.
Em outubro/novembro de 2025 as sementes de cada cultivar serão semeadas em seis baldes contendo solo da região de Capão do Leão, e mantidas em casa de vegetação com controle de temperatura, que será compatível com o ótimo para cada estádio de desenvolvimento. O manejo será feito conforme as recomendações para cultura (SOSBAI, 2022). Será utilizado delineamento de blocos ao acaso, com três repetições. Cada repetição será composta por 3 plantas. Quando as plantas estiverem no estádio R4 serão submetidas à duas condições: i) estresse por calor 39°C de dia e 28°C de noite durante dois dias, com fotoperíodo de 12 horas de luz e 12 horas de escuro (transferência para câmara de crescimento); ii) controle (manutenção em casa vegetação). Após o período de estresse ou manutenção na condição controle, será feita coleta de panículas de cada genótipo em cada condição. Os tecidos coletados serão fixados em nitrogênio líquido e armazenados em ultra freezer até a extração de RNA. Serão coletadas 12 amostras (2 genótipos x 2 condições x 3 repetições).

***No experimento II será utilizado período de estresse por calor de dois dias (ao invés de quatro dias) pois se busca analisar os mecanismos moleculares de sinalização e transcrição, os quais ocorrem principalmente nas fases inicias do estresse.

Extração de RNA
Panículas de cada genótipo de arroz (cultivar mais sensível e cultivar mais tolerante), de cada condição (controle e estresse por calor), e de cada repetição, serão macerados com nitrogênio líquido. O RNA total será extraído utilizando o reagente PureLinkTM Plant RNA Reagent (InvitrogenTM), de acordo com as recomendações do fabricante. A quantidade e qualidade/pureza das amostras de RNA serão verificadas em espectrofotômetro Nanovue e a integridade do RNA será analisada utilizando eletroforese em gel de agarose.

 
Sequenciamento de RNA (RNASeq)
As bibliotecas de RNA serão enviadas para sequenciamento em equipamento IlimminaHiSeq 2000 no Laboratório de Genômica Funcional Aplicada à Agropecuária e Agroenergia- ESALQ/USP (Piracicaba-SP). As bibliotecas serão preparadas por meio do kit TruSeq RNA Sample Preparation® V 2 (IlluminaTM), segundo recomendações do fabricante. A qualidade das bibliotecas será avaliada com o equipamento Agilent 2100 BioAnalyzer® (Agilent TechnologiesTM) utilizando o kit Agilent DNA 1000® (AgilentTM). O sequenciamento das bibliotecas será do tipo paired-end 2x100pb realizado na plataforma HiSeq 2500® (IlluminaTM) (Amaral et al. 2016; Maia et al. 2016).

Análise de dados de RNASeq
Na etapa pós-sequenciamento, serão utilizados os pacotes de bioinformática indicados para a tecnologia Illumina. Para a análise e visualização da qualidade das reads será utilizado o programa FastQC. Após, o programa Trimmomatic Ver. 0.32 será utilizado para a remoção das bases com baixa qualidade e dos adaptadores de cada biblioteca.
O programa HISAT2 v2-2.0.5 (Kim et al. 2015) será utilizado para o mapeamento das reads na pseudomolécula do genoma do arroz (Oryza sativa cv. Nipponbare-IRGSP). A contagem e normalização do número de transcritos será obtida utilizando o programa StringTie e o pacote Ballgown (Pertea et al. 2016).
Para análise de expressão diferencial serão avaliados apenas aqueles transcritos com valor de FPKM (Fragments Per Kilobase Of Exon Per Million Fragments Mapped) com valor mínimo de 1 (≥ 1) e com valores de Log2FC menores que -1 ou maiores que +1. Os níveis de expressão serão analisados em escala FPKM, sendo considerados genes diferencialmente expressos (DEGs) os que apresentarem valores de P≤ 0,05 (Maia et al. 2016).
As sequencias dos transcritos serão submetidas a diferentes análises para obtenção de informações sobre a função molecular, o processo biológico e a que componente celular corresponde cada gene expresso. Também serão construídos pipelines para comparações dos transcritos (genes) e os bancos de dados de arroz. Outras análises serão feitas com o programa Blast2GO (Conesa e Götz, 2005).

Metas
Caracterizar fenotipicamente pelo menos 20 cultivares de arroz em resposta ao estresse por calor no estádio reprodutivo até abril de 2025.
Identificar pelo menos dois genótipos de arroz com resposta contrastante ao estresse por calor no estádio reprodutivo até abril de 2025.
Implantar o experimento sob estresse por calor no estádio reprodutivo com as cultivares contrastantes até fevereiro de 2026.
Extrair RNA total de 12 amostras de tecido vegetal até abril de 2026.
Sequenciar 12 amostras de RNA até julho de 2026.
Tratar os dados e identificar pelo menos 100 DEGs em resposta ao calor até dezembro de 2026.
Identificar a função de pelo menos 100 DEGs de resposta ao calor até dezembro de 2026.
Submeter pelo menos um artigo científico para revista de fator de impacto elevado até julho de 2027.

Com a execução da proposta espera-se:
Caracterizar o comportamento das cultivares de arroz mais plantadas no Sul do Brasil frente ao estresse por alta temperatura no estádio reprodutivo. As cultivares mais tolerantes podem ser indicadas para cultivo em locais que enfrentam temperaturas elevadas durante o verão.
Identificar genótipos de arroz com resposta contrastante ao estresse por alta temperatura no reprodutivo. Esses genótipos podem ser empregados em diferentes estudos genéticos para elucidação da resposta ao estresse por calor.
Elucidar a base molecular da resposta ao estresse por alta temperatura em arroz e identificar genes envolvidos com essa característica. O conhecimento obtido pode auxiliar os melhoristas na criação de cultivares tolerantes por meio de melhoramento convencional, transgenia e edição de genomas.
A longo prazo, os resultados obtidos podem contribuir para combater os impactos ocasionados pelas mudanças climáticas e colaborar para alcançar aumento da produtividade e produção de arroz visando a segurança alimentar global.