Objetivo 1: caracterizar os efeitos da RC no início da vida na expectativa de vida e adaptações metabólicas em camundongos mais velhos.
Design experimental: Pares de camundongos HET3 machos e fêmeas (3 meses de idade) serão mantidos em condições controladas para geração de ninhadas. Após o nascimento, cada ninhada será ajustada para 8 filhotes/mãe (CTL) ou 12 filhotes/mãe (CR) [5]. Após o desmame, com 3 semanas de idade, os camundongos serão sexados e separados em mais dois grupos para receber ração ad libitum ou 30% de RC até 8 semanas de idade e, então, retornarão à ração ad libitum (Figura 3). A ingestão do grupo CTL será medida em dias alternados para ajustar a ingestão do grupo CR. Após 8 semanas de idade, os dados de consumo alimentar e peso corporal serão coletados uma vez por semana. Aos 2, 9, 12, 15 e 18 meses de idade, os camundongos serão sacrificados após um jejum de 4 horas. Ovários, testículos, fígado, músculo e tecido adiposo (perigonadal, peri-renal, subcutâneo e marrom) serão dissecados, pesados e armazenados a -80ºC e solução de paraformaldeído a 4%. Os camundongos restantes serão mantidos para medição de longevidade.
Métodos experimentais
Parâmetros sanguíneos: O sangue será centrifugado e o soro armazenado a -80ºC. As concentrações séricas de IGF-I, FGF21 e um painel de citocinas serão determinadas por kits ELISA comerciais. O sangue coletado da veia submandibular com 3 e 6 semanas de idade também será usado para medir os níveis de FGF21 e IGF-I.
Puberdade: Verificaremos a abertura vaginal em fêmeas e a separação da glândula prepucial em machos [35] para determinar a idade na puberdade.
Metabolismo da glicose: O metabolismo da glicose será avaliado usando testes de tolerância à insulina (ITT) e testes de tolerância à glicose (GTT) aos 2, 9, 12, 15 e 18 meses de idade usando um glicosímetro [36].
Análise transcriptômica/epigenômica: Os depósitos de tecido adiposo congelado (perigonadal, perirrenal, subcutâneo e marrom) coletados aos 2, 12 e 18 meses de idade serão usados para extração de RNA/DNA. A preparação e sequenciamento da biblioteca de mRNA específica da fita serão realizados conforme descrito anteriormente [37]. Além disso, o DNA será usado para protocolos de sequenciamento de bissulfito oxidativo, conforme também descrito anteriormente [37], para identificar níveis de metilação (mCG e mCH) e hidroximetilação (hmCG). A análise bioinformática será realizada conforme descrito anteriormente para observar vias reguladas e interação entre regiões metiladas e mudanças na expressão gênica.
Western blot: O fígado congelado e o tecido adiposo serão homogeneizados, os lisados serão separados por SDS/PAGE, transferidos para membranas de nitrocelulose e sondados com anticorpos primários. IGF-I e FGF21 serão medidos em amostras de fígado e UCP1 em depósitos de tecido adiposo. As bandas serão visualizadas usando um anticorpo secundário conjugado com peroxidase e um kit de detecção de quimioluminescência.
Imunofluorescência: As seções de tecido adiposo serão processadas conforme descrito anteriormente por nosso grupo [38]. Usaremos seccionamento serial a 5 uM para incluir múltiplos anticorpos primários para detectar ADSC (positivo para CD29, CD44, CD90, CD34, CD73 e CD105) [39] e infiltração de macrófagos M1/M2 (F4/80, CD68, CD86, CD11c, CD206, Arginase, IbA1).
Expectativa de vida: Após 8 semanas de idade, os camundongos reservados para o estudo de longevidade não serão expostos a nenhuma outra manipulação, exceto para registro do peso corporal a cada duas semanas. Os camundongos serão inspecionados diariamente para determinar o momento da morte espontânea. Os camundongos que apresentarem perda grave de peso corporal e sinais de sofrimento serão sacrificados sob anestesia. Os camundongos serão dissecados e avaliados por um patologista para determinar a causa da morte.
Objetivo 2: Caracterizar os efeitos da injeção de FGF21 na expectativa de vida e adaptações metabólicas em camundongos mais velhos.
Projeto experimental: Pares de camundongos HET3 machos e fêmeas (3 meses de idade) serão mantidos em condições controladas para geração de ninhadas. Após o nascimento, cada ninhada será ajustada para 8 filhotes/mãe (CTL). Após o desmame, com 3 semanas de idade, os camundongos serão sexados e separados em gaiolas recebendo ração regular. Os camundongos receberão injeções i.p. de FGF21 duas vezes ao dia (1 mg/kg) [42-44]. O FGF21 será injetado de 1 a 3 semanas, 3 a 8 semanas ou de 1 a 8 semanas de idade (Figura 4). A ingestão será medida em dias alternados e o peso corporal duas vezes por semana. Após 8 semanas de idade, os dados de consumo de alimentos e peso corporal serão coletados uma vez por semana. Os camundongos serão sacrificados após um jejum de 4 horas aos 2, 9, 12, 15 e 18 meses de idade. Ovários, testículos, fígado, músculo e tecido adiposo (perigonadal, perirrenal, subcutâneo e marrom) serão dissecados, pesados e armazenados a -80ºC e solução de paraformaldeído a 4%. Os camundongos restantes serão mantidos para medição de longevidade.
Métodos experimentais
Seguiremos os mesmos métodos descritos para o Objetivo 1.
Objetivo 3: Medir os efeitos da CR no início da vida ou injeção de FGF21 na capacidade reprodutiva de camundongos.
Desenho experimental: camundongos machos e fêmeas serão tratados conforme descrito para os objetivos anteriores. Prevemos que uma injeção de CR FGF21 mais longa, de 1 a 8 semanas, promoverá os resultados mais benéficos em relação à expectativa de vida e às adaptações metabólicas. Portanto, propomos usar essas intervenções no Objetivo 3. Neste objetivo, as fêmeasos camundongos serão cruzados com camundongos machos jovens (3-4 meses) não tratados aos 3, 9, 12, 15 e 18 meses de idade. Os reprodutores serão pareados na proporção de 1 macho:2 fêmeas e mantidos juntos por 20 dias em cada ponto de tempo. O número de fêmeas prenhes, bem como o tamanho da ninhada serão registrados. Em cada ponto de tempo, novos camundongos machos jovens serão introduzidos para reprodução. Para testar a fertilidade dos camundongos machos, o mesmo design será aplicado. Em cada ponto de tempo, um subconjunto de camundongos machos e fêmeas será sacrificado após um jejum de 4 horas. Os ovários e testículos serão dissecados, pesados e armazenados a -80ºC e solução de paraformaldeído a 4%. Avaliaremos a reserva ovariana, os ciclos estrais e a taxa de ovulação nas fêmeas e o tamanho dos testículos, a qualidade e a concentração do sêmen nos machos. Métodos experimentais
Análise do ciclo estral: esfregaços vaginais serão obtidos diariamente por um período de 12 dias aos 3, 9, 12, 15 e 18 meses de idade. O material coletado será depositado em uma lâmina e corado usando coloração panóptica rápida para classificar o estágio do ciclo estral.
Parâmetros sanguíneos: O sangue coletado será centrifugado e o soro armazenado a -80ºC. As concentrações séricas de estradiol, progesterona e testosterona serão determinadas por LC/MS/MS [30] e LH e FSH usando kits ELISA.
Qualidade do oócito: Os camundongos serão superovulados usando eCG e hCG, os ovidutos coletados e os oócitos recuperados. Os oócitos serão contados e corados com corantes fluorescentes específicos para mitocôndrias, acúmulo de gordura, estresse oxidativo e avaliados em um microscópio confocal (Olympus FluoViewTM 1000).
Análise do sêmen: Isso será feito de acordo com publicação anterior do nosso grupo [30]. Após a eutanásia dos machos, o epidídimo será removido, pesado e colocado em um microtubo contendo solução extensora pré-aquecida (36,5 °C) para liberar o esperma. A concentração do esperma será determinada usando um hemocitômetro. A motilidade do esperma será avaliada usando um microscópio acoplado a um sistema de análise de sêmen assistido por computador (CASA). Os defeitos morfológicos serão avaliados em uma lâmina corada usando um método panóptico rápido sob o microscópio. Para análise da integridade do acrossoma, o sêmen será incubado com Lectina do conjugado FITC de Arachis hypogaea e avaliado sob um microscópio confocal.
Histologia do ovário e dos testículos: Para avaliação histológica, as amostras ovarianas serão incluídas em Paraplast e cortadas sequencialmente em uma espessura de 5 μm, com 1 em cada 6 seções sendo removidas, colocadas em lâminas e coradas com H&E. A classificação dos folículos ovarianos será determinada conforme feito anteriormente por nosso grupo [25] para indicar o número de folículos/seção. Um dos testículos também será incluído no Paraplast e cortado transversalmente em seções de 5 μm, colocadas em lâminas e coradas com H&E. Em cada seção, túbulos seminíferos redondos ou quase redondos serão medidos quanto ao perímetro, área e diâmetro.