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A restrição calórica (RC) é uma das intervenções mais eficazes para prolongar a vida útil em camundongos adultos [1]. Uma redução de 30% na ingestão calórica aumenta a sensibilidade à insulina, reduz a inflamação e melhora várias características do envelhecimento [2]. No entanto, os benefícios da RC desaparecem rapidamente quando os camundongos retornam à alimentação ad libitum [3]. Notavelmente, a RC exclusivamente antes do desmame induz adaptações metabólicas duradouras e prolonga a vida útil [4]. Camundongos submetidos à restrição energética no início da vida apresentam pesos corporais mais baixos no desmame, uma diferença que persiste na idade adulta [5]. Esses camundongos também apresentam redução de gordura corporal, adipócitos menores e maior sensibilidade à insulina na idade adulta [5], indicando adaptações metabólicas de longo prazo na função do tecido adiposo branco (TAB). Camundongos com deficiência de hormônio do crescimento (GH) nascem com tamanho normal, mas apresentam crescimento mais lento devido à deficiência grave de GH/fator de crescimento semelhante à insulina I (IGF-I) [6]. Esses camundongos compartilham várias características com camundongos CR, incluindo puberdade tardia, menor tamanho corporal adulto e maior expectativa de vida [6]. Quando o GH exógeno é administrado entre 2 e 8 semanas de idade em camundongos com deficiência de GH, a taxa de crescimento aumenta e a expectativa de vida é reduzida [7, 8]. Da mesma forma, linhagens de camundongos com níveis mais baixos de IGF-I apresentam menor peso corporal, puberdade tardia e expectativa de vida estendida [9]. Essas descobertas ilustram que a expectativa de vida pode ser programada em janelas de desenvolvimento específicas, permitindo intervenções direcionadas para aumentar a longevidade. Várias teorias propõem uma compensação entre reprodução e expectativa de vida [10], o que significa que uma expectativa de vida aumentada reduz a aptidão reprodutiva. A puberdade tardia associada à taxa de crescimento mais lenta reflete essa adaptação. Mostramos que camundongos fêmeas submetidos à CR têm maior expectativa de vida reprodutiva, apesar de terem ovulações reduzidas e ciclos estrais mais longos durante a intervenção [11-13]; inversamente, a CR não impactou muito a produção de espermatozoides em machos [14]. Portanto, ainda não está claro se a CR no início da vida afeta igualmente a aptidão reprodutiva em machos e fêmeas. Nesse sentido, o FGF21 regula a resposta à fome e pode desempenhar um papel central nesse processo. Camundongos que superexpressam FGF21 compartilham várias características com camundongos deficientes em GH, como tamanho corporal menor e maior expectativa de vida [15]. O FGF21 aumenta a sensibilidade à insulina, reduz os níveis de IGF-I e estimula o WAT beiging [16]. O termogênico bege WAT contendo UCP1 está associado a um fenótipo magro e tolerante à glicose em camundongos [17]. Camundongos knockout para FGF21 apresentam crescimento aumentado em comparação com camundongos WT sob RC, o que foi revertido pela injeção de FGF21 [18]. No entanto, o papel do FGF21 na RC permanece controverso. Alguns indicam que o FGF21 aumenta em camundongos fêmeas, mas não em camundongos machos submetidos à RC [19]. Portanto, várias questões-chave permanecem sem resposta: (1) A RC no início da vida afeta os níveis de FGF21/IGF-I e o tempo até a puberdade em machos e fêmeas? (2) A injeção de FGF21 no início da vida pode reduzir os níveis de IGF-I e imitar as alterações induzidas pela RC? (3) A injeção de FGF21 no início da vida pode aumentar a expectativa de vida? (4) A intervenção no início da vida com RC ou FGF21 afeta a função reprodutiva na idade adulta de forma diferente em homens e mulheres? Nossa hipótese é que a secreção de FGF21 media os efeitos da ingestão de energia no início da vida, reduzindo o IGF-I e promovendo adaptações metabólicas de longo prazo no WAT que aumentam a expectativa de vida ao custo da aptidão reprodutiva. Até o momento, muito poucos estudos avaliaram os efeitos das intervenções que manipulam a ingestão de energia [4, 5] ou o eixo GH/IGF-I [7, 8] no início da vida e seus efeitos na expectativa de vida dos camundongos. Apesar da evidência do aumento da expectativa de vida, pouco se sabe sobre os mecanismos que ligam o desenvolvimento no início da vida e essas adaptações metabólicas de longa duração [20]. Observamos um aumento na população de células-tronco derivadas de tecido adiposo (ADSCs) no WAT de camundongos adultos com deficiência de GH [21]; no entanto, não há evidências sobre a composição do WAT quando as intervenções são limitadas ao início da vida. Portanto, também levantamos a hipótese de que a composição e a função do WAT são permanentemente alteradas quando camundongos são submetidos a intervenções no início da vida.

Objetivo 1: caracterizar os efeitos da RC no início da vida na expectativa de vida e adaptações metabólicas em camundongos mais velhos.
Design experimental: Pares de camundongos HET3 machos e fêmeas (3 meses de idade) serão mantidos em condições controladas para geração de ninhadas. Após o nascimento, cada ninhada será ajustada para 8 filhotes/mãe (CTL) ou 12 filhotes/mãe (CR) [5]. Após o desmame, com 3 semanas de idade, os camundongos serão sexados e separados em mais dois grupos para receber ração ad libitum ou 30% de RC até 8 semanas de idade e, então, retornarão à ração ad libitum (Figura 3). A ingestão do grupo CTL será medida em dias alternados para ajustar a ingestão do grupo CR. Após 8 semanas de idade, os dados de consumo alimentar e peso corporal serão coletados uma vez por semana. Aos 2, 9, 12, 15 e 18 meses de idade, os camundongos serão sacrificados após um jejum de 4 horas. Ovários, testículos, fígado, músculo e tecido adiposo (perigonadal, peri-renal, subcutâneo e marrom) serão dissecados, pesados ​​e armazenados a -80ºC e solução de paraformaldeído a 4%. Os camundongos restantes serão mantidos para medição de longevidade.
Métodos experimentais
Parâmetros sanguíneos: O sangue será centrifugado e o soro armazenado a -80ºC. As concentrações séricas de IGF-I, FGF21 e um painel de citocinas serão determinadas por kits ELISA comerciais. O sangue coletado da veia submandibular com 3 e 6 semanas de idade também será usado para medir os níveis de FGF21 e IGF-I.
Puberdade: Verificaremos a abertura vaginal em fêmeas e a separação da glândula prepucial em machos [35] para determinar a idade na puberdade.
Metabolismo da glicose: O metabolismo da glicose será avaliado usando testes de tolerância à insulina (ITT) e testes de tolerância à glicose (GTT) aos 2, 9, 12, 15 e 18 meses de idade usando um glicosímetro [36].
Análise transcriptômica/epigenômica: Os depósitos de tecido adiposo congelado (perigonadal, perirrenal, subcutâneo e marrom) coletados aos 2, 12 e 18 meses de idade serão usados ​​para extração de RNA/DNA. A preparação e sequenciamento da biblioteca de mRNA específica da fita serão realizados conforme descrito anteriormente [37]. Além disso, o DNA será usado para protocolos de sequenciamento de bissulfito oxidativo, conforme também descrito anteriormente [37], para identificar níveis de metilação (mCG e mCH) e hidroximetilação (hmCG). A análise bioinformática será realizada conforme descrito anteriormente para observar vias reguladas e interação entre regiões metiladas e mudanças na expressão gênica.
Western blot: O fígado congelado e o tecido adiposo serão homogeneizados, os lisados ​​serão separados por SDS/PAGE, transferidos para membranas de nitrocelulose e sondados com anticorpos primários. IGF-I e FGF21 serão medidos em amostras de fígado e UCP1 em depósitos de tecido adiposo. As bandas serão visualizadas usando um anticorpo secundário conjugado com peroxidase e um kit de detecção de quimioluminescência.
Imunofluorescência: As seções de tecido adiposo serão processadas conforme descrito anteriormente por nosso grupo [38]. Usaremos seccionamento serial a 5 uM para incluir múltiplos anticorpos primários para detectar ADSC (positivo para CD29, CD44, CD90, CD34, CD73 e CD105) [39] e infiltração de macrófagos M1/M2 (F4/80, CD68, CD86, CD11c, CD206, Arginase, IbA1).
Expectativa de vida: Após 8 semanas de idade, os camundongos reservados para o estudo de longevidade não serão expostos a nenhuma outra manipulação, exceto para registro do peso corporal a cada duas semanas. Os camundongos serão inspecionados diariamente para determinar o momento da morte espontânea. Os camundongos que apresentarem perda grave de peso corporal e sinais de sofrimento serão sacrificados sob anestesia. Os camundongos serão dissecados e avaliados por um patologista para determinar a causa da morte.

Objetivo 2: Caracterizar os efeitos da injeção de FGF21 na expectativa de vida e adaptações metabólicas em camundongos mais velhos.
Projeto experimental: Pares de camundongos HET3 machos e fêmeas (3 meses de idade) serão mantidos em condições controladas para geração de ninhadas. Após o nascimento, cada ninhada será ajustada para 8 filhotes/mãe (CTL). Após o desmame, com 3 semanas de idade, os camundongos serão sexados e separados em gaiolas recebendo ração regular. Os camundongos receberão injeções i.p. de FGF21 duas vezes ao dia (1 mg/kg) [42-44]. O FGF21 será injetado de 1 a 3 semanas, 3 a 8 semanas ou de 1 a 8 semanas de idade (Figura 4). A ingestão será medida em dias alternados e o peso corporal duas vezes por semana. Após 8 semanas de idade, os dados de consumo de alimentos e peso corporal serão coletados uma vez por semana. Os camundongos serão sacrificados após um jejum de 4 horas aos 2, 9, 12, 15 e 18 meses de idade. Ovários, testículos, fígado, músculo e tecido adiposo (perigonadal, perirrenal, subcutâneo e marrom) serão dissecados, pesados ​​e armazenados a -80ºC e solução de paraformaldeído a 4%. Os camundongos restantes serão mantidos para medição de longevidade.
Métodos experimentais
Seguiremos os mesmos métodos descritos para o Objetivo 1.

Objetivo 3: Medir os efeitos da CR no início da vida ou injeção de FGF21 na capacidade reprodutiva de camundongos.
Desenho experimental: camundongos machos e fêmeas serão tratados conforme descrito para os objetivos anteriores. Prevemos que uma injeção de CR FGF21 mais longa, de 1 a 8 semanas, promoverá os resultados mais benéficos em relação à expectativa de vida e às adaptações metabólicas. Portanto, propomos usar essas intervenções no Objetivo 3. Neste objetivo, as fêmeasos camundongos serão cruzados com camundongos machos jovens (3-4 meses) não tratados aos 3, 9, 12, 15 e 18 meses de idade. Os reprodutores serão pareados na proporção de 1 macho:2 fêmeas e mantidos juntos por 20 dias em cada ponto de tempo. O número de fêmeas prenhes, bem como o tamanho da ninhada serão registrados. Em cada ponto de tempo, novos camundongos machos jovens serão introduzidos para reprodução. Para testar a fertilidade dos camundongos machos, o mesmo design será aplicado. Em cada ponto de tempo, um subconjunto de camundongos machos e fêmeas será sacrificado após um jejum de 4 horas. Os ovários e testículos serão dissecados, pesados ​​e armazenados a -80ºC e solução de paraformaldeído a 4%. Avaliaremos a reserva ovariana, os ciclos estrais e a taxa de ovulação nas fêmeas e o tamanho dos testículos, a qualidade e a concentração do sêmen nos machos. Métodos experimentais
Análise do ciclo estral: esfregaços vaginais serão obtidos diariamente por um período de 12 dias aos 3, 9, 12, 15 e 18 meses de idade. O material coletado será depositado em uma lâmina e corado usando coloração panóptica rápida para classificar o estágio do ciclo estral.
Parâmetros sanguíneos: O sangue coletado será centrifugado e o soro armazenado a -80ºC. As concentrações séricas de estradiol, progesterona e testosterona serão determinadas por LC/MS/MS [30] e LH e FSH usando kits ELISA.
Qualidade do oócito: Os camundongos serão superovulados usando eCG e hCG, os ovidutos coletados e os oócitos recuperados. Os oócitos serão contados e corados com corantes fluorescentes específicos para mitocôndrias, acúmulo de gordura, estresse oxidativo e avaliados em um microscópio confocal (Olympus FluoViewTM 1000).
Análise do sêmen: Isso será feito de acordo com publicação anterior do nosso grupo [30]. Após a eutanásia dos machos, o epidídimo será removido, pesado e colocado em um microtubo contendo solução extensora pré-aquecida (36,5 °C) para liberar o esperma. A concentração do esperma será determinada usando um hemocitômetro. A motilidade do esperma será avaliada usando um microscópio acoplado a um sistema de análise de sêmen assistido por computador (CASA). Os defeitos morfológicos serão avaliados em uma lâmina corada usando um método panóptico rápido sob o microscópio. Para análise da integridade do acrossoma, o sêmen será incubado com Lectina do conjugado FITC de Arachis hypogaea e avaliado sob um microscópio confocal.
Histologia do ovário e dos testículos: Para avaliação histológica, as amostras ovarianas serão incluídas em Paraplast e cortadas sequencialmente em uma espessura de 5 μm, com 1 em cada 6 seções sendo removidas, colocadas em lâminas e coradas com H&E. A classificação dos folículos ovarianos será determinada conforme feito anteriormente por nosso grupo [25] para indicar o número de folículos/seção. Um dos testículos também será incluído no Paraplast e cortado transversalmente em seções de 5 μm, colocadas em lâminas e coradas com H&E. Em cada seção, túbulos seminíferos redondos ou quase redondos serão medidos quanto ao perímetro, área e diâmetro.

Produção de uma dissertação de mestrado, uma tese e 3 artigos científicos em revistas Qualis A1.