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O envelhecimento ovariano é um processo caracterizado pelo declínio progressivo da reserva folicular ovariana [1] marcado pela ativação dos folículos primordiais. Esse mecanismo ainda não é completamente entendido, mas é fundamental, pois leva à diminuição quantitativa e qualitativa dos folículos e dos oócitos [2]. Como consequência, observa-se impactos adversos na qualidade embrionária, um aumento na taxa de abortos e uma maior prevalência de anomalias cromossômicas à medida que a idade avança [3]. A restrição calórica (RC), definida como a redução do consumo alimentar sem causar desnutrição, é reconhecida por promover a longevidade e diminuir a incidência de doenças relacionadas ao envelhecimento [4]. Essa estratégia nutricional age modulando processos biológicos como a inflamação, adiposidade, estresse oxidativo e a sensibilidade a nutrientes [5, 6]. Notavelmente, a RC tem mostrado capacidade de prolongar a funcionalidade da reserva ovariana, evidenciando uma desaceleração no processo de ativação folicular e, por conseguinte, na depleção da reserva ovariana, o que sugere um impacto positivo potencial na função reprodutiva feminina.[7, 8]. Pesquisas apontam que a aplicação de RC em intensidades de até 30% pode mitigar a ativação de folículos primordiais, favorecendo a conservação da reserva ovariana [7, 8]. Entretanto, estudos recentes do nosso grupo indicam que uma RC de 10% já é eficaz na preservação da reserva ovariana de forma comparável a uma restrição de 30% [9]. Isso porque a ativação dos folículos primordiais é regulada por uma interação de vários ciclos celulares e vias de crescimento. Isso ocorre porque a ativação dos folículos primordiais é regulada por uma série vias de sinalização. Por exemplo, a ativação da via mTORC1 nas células pré-granulosas do folículo primordial aumenta a expressão do KITL, que se liga ao receptor KIT na superfície do oócito, ativando a via PI3K/AKT, resultando na fosforilação do FOXO3a e na ativação do folículo [10]. Visto que, as vias mTOR e FOXO são amplamente reconhecidas por mediar os efeitos de dietas restritivas na expectativa de vida, uma vez que a RC é capaz de diminuir a ativação de mTOR [7, 9]. Dados do nosso grupo indicam que a restrição de 67% de proteína ou BCAA reduziu a ativação de folículos primordiais, semelhante ao observado para 30% CR, sugerindo um papel central para os BCAAs mediando o efeito de dietas restritivas no envelhecimento ovariano, entretanto os animais apresentaram maior ingesta colórica [11]. Além disso, estudos demonstraram que a longevidade e a saúde metabólica são favorecidas por dietas com baixo teor de proteínas e alto teor de carboidratos. No contexto ovariano, a ativação dos folículos primordiais foi diminuída pela restrição de proteínas e acelerada pelo aumento da ingestão proteica, associada à modulação do mTOR [12]. Assim como dietas ricas em gorduras prejudicam a função reprodutiva e reserva ovariana [13]. Quanto à atividade física, embora alguns estudos sugerem que o exercício pode aumentar os níveis de AMH em mulheres [14] , a sua relação com a ativação dos folículos primordiais ainda não foi avaliada. Apesar do exercício contribuir para o aumento da expectativa de vida, ele não parece estar relacionado a um aumento na expectativa de vida máxima, diferentemente das intervenções dietéticas. Portanto, é crucial entender o impacto da atividade física no envelhecimento ovariano [15].
Comparar a atividade física com a restrição calórica é pertinente, considerando que a RC implica na diminuição de proteínas [16] e BCAAs [11] , enquanto a atividade física leva ao aumento do gasto calórico e ao catabolismo de BCAAs [17]. A exploração de diferentes dietas e tipos de jejum contribuirá para elucidar aspectos ainda não compreendidos sobre a RC e seu efeito no envelhecimento ovariano. Além disso, é relevante observar animais em RC envolve períodos de jejum, já que a alimentação é disponibilizada apenas uma vez por dia [7, 9, 18]. Em geral, observamos que os animais ingerem toda a alimentação em um período de 3 horas após o fornecimento o que leva há um jejum de aproximadamente 20 horas que pode explicar grande parte dos efeitos benéficos da RC em camundongos [19]. Estudos com jejum intermitente em camundongos, onde a alimentação é feita a vontade em um dia e removida por um intervalo de 24 hs, mostram efeitos positivos no aumento da longevidade [20]. No entanto, os resultados de saúde metabólica são menos robustos do que em dietas de RC de 30% onde além do período de jejum há uma restrição da quantidade de energia ingerida.

Camundongos fêmeas (n=165) da linhagem C57BL/6 com idade de três meses serão mantidos sob condições controladas de luz e temperatura. Os camundongos serão divididos em 11 grupos (n=15/grupo), respectivamente, da seguinte maneira: Grupo 1: camundongos controle, grupo 2: camundongos restrição calórica 30%, grupo 3: camundongos restrição calórica 10%, grupo 4: camundongos restrição calórica 30% recebendo dieta rica em AA, grupo 5: camundongos restrição calórica 30% recebendo dieta rica em AA essenciais, grupo 6: camundongos restrição calórica 30% recebendo dieta rica em AA não essenciais, grupo 7: camundongos restrição calórica 30% recebendo dieta rica em BCAAs, grupo 8: camundongos restrição calórica 30% recebendo dieta rica em gordura, grupo 9: camundongos restrição calórica 30% sem jejum (aumento de celulose na dieta), grupo 10: camundongos jejum intermitente (100% da ingesta oferecido em um único momento junto com o grupo RC), grupo 11: camundongos controle com exercício resistido. Os tratamentos terão duração de oito meses. As dietas serão preparadas no laboratório de acordo com formulação padrão para roedores com modificações de acordo com o grupo experimental [25]. Para aumento dos AAs e gordura nos grupos tratamento será reduzida a quantidade de carboidratos na dieta. Para obtenção da restrição energética de 30% sem jejum proposta no grupo 9 será usada uma ração com excesso de celulose visando reduzir a ingesta energética total dos animais. Para obter o jejum intermitente sem restrição de calorias será fornecida 100% da ração conforme consumo do grupo controle no mesmo momento dos grupos RC. Dados anteriores indicam que os animais consomem rapidamente o alimento visto que não há sobras, impondo um período de jejum sem ocorrência de restrição de calorias. Dados anteriores de nosso grupo sugerem um declínio acentuado no número de folículos primordiais entre seis e nove meses de idade em camundongos, portanto, escolhemos esta janela de intervenção [26]. Para o exercício resistido, os camundongos serão submetidos a um exercício de subir uma escada de de 1 metro de altura com grades de 1,5 cm, três dias por semana com cargas adicionadas à base da cauda. O peso da carga aumentará 50% da massa corporal dos camundongos a cada duas semanas, até 200%, de acordo com protocolo de nosso grupo [27]. Camundongos sedentários serão submetidos ao mesmo manejo sem exercício. Ao longo do estudo dados de consumo alimentar serão coletados todos os dias e os dados de peso corporal serão coletados uma vez por semana. Será avaliado diariamente o comportamento e socialização dos animais entre outras medidas de bem-estar como: avaliação da atividade motora, alteração da aparência, como postura encurvada, piloereção, secreção ocular ou nasal; alteração no temperamento, aumento da agressividade, relutância em interagir, batimento ou rangido dos dentes, aumento ou diminuição da vocalização; alterações no consumo de alimentos ou água, perda de peso. Será considerado como ponto final humanitário os animais que apresentarem significativa perda de peso no intervalo de uma semana, não estejam se alimentando, sem movimentação e que apresente postura encurvada.
Ao final do experimento os animais serão submetidos ao teste de tolerância a insulina com aplicação intraperitoneal de 0,5 UI/kg de insulina após 2 horas de jejum e medição de glicose através de uma pequena incisão na ponta da cauda nos momentos 0, 15, 30 e 60 min após injeção [24]. Previamente ao momento da eutanásia (aos 11 meses de idade) será sincronizado o ciclo estral das fêmeas. Para sincronização as fêmeas receberão uma dose intraperitoneal de eCG (5 UI) e 48hs depois uma dose de hCG (5 UI) para sincronização da ovulação [9]. Aproximadamente 12 horas após a injeção de hCG os camundongos fêmeas serão anestesiados e eutanasiados após 4 horas de jejum. Será feita punção cardíaca para coleta de sangue total. Após os camundongos serão dissecados e o tecido ovariano, uterino, hepático, muscular e adiposo será coletado para pesagem e análises laboratoriais. O sangue será centrifugado para separação do soro e avaliação bioquímica. Os ovidutos serão separados e lavados com meio de cultivo para coleta de oócitos que serão avaliado sob estereomicroscópio para contagem do numero e estágio de desenvolvimento.
Os ovários serão processados histologicamente, e o número de folículos primordiais, primários, secundários e terciários será contado em cortes seriados de todo o ovário. O diâmetro do folículo e do oócito em cada categoria de folículo será medido. Laminas de imunofluorescência serão preparadas para a marcação da ativação mTOR e FOXO3a nos folículos primordiais. A concentração de estradiol beta será avaliado por LC/MS/MS conforme descrito anteriormente. A concentração de BCAA sérica será medida usando um kit comercial (Biovision, Milpitas, CA, EUA, #K564-100) em soro, ovário, fígado, músculo e tecido adiposo.

Produção de uma tese de doutorado e dois artigos científicos