Portal InstitucionalUFPEL

Atualmente o crescente aumento do número de casos da doença, que é uma zoonose, vem aumentando consideravelmente no país ao longo dos últimos anos, sendo uma grande problemática na Saúde Única. Diante da expansão da doença em estados onde anteriormente não havia relato de ocorrência, além dos prejuízos à saúde dos felinos acometidos gerando grande debilidade, onde a doença se manifesta de maneira agressiva e de progressão à cronicidade; inclusive com relatos de caso referentes à resistência fúngica ao tratamento padrão. Frente a prevalência e ao atual panorama dessa zoonose no Brasil, surge a necessidade de mais estudos relacionados a doença, bem como a investigação de novas alternativas terapêuticas ao tratamento dessa zoonose de importância na Saúde Única.

Os óleos comerciais utilizados nesse estudo serão adquiridos de empresa comercial com certificado de qualidade e caracterizados por cromatografia.
Análise in vitro
No ensaio in vitro as culturas fúngicas previamente selecionadas serão desafiadas aos compostos em diferentes concentrações por meio da nebulização, e posteriormente serão analisadas suas respostas frente ao desafio das colônias cultivadas. Ao longo deste processo será possível obter as concentrações inibitórias mínimas necessárias para o combate micológico, bem como as doses necessárias para ação fungicida através da concentração fungicida mínima avaliando também a ação fungiostática tanto dos óleos como a nanopartícula. Também serão realizados ensaios de citotoxicidade in vitro por cultivo celular de células linhagem CRFK (Crandell Rees Feline Kidney), bem como genotoxicidade através do ensaio cometa.
Determinação da concentração inibitória e fungicida mínima (CIM e CFM)
A atividade antifúngica será determinada através da técnica de microdiluição em caldo em microplacas de 96 poços, em duplicata, seguindo as diretrizes do documento M27- A3 do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2008), as subculturas fúngicas serão cultivadas em meio Brain-Heart-Infusion (BHI/Acumedia®, Lansing, Michigan, EUA) à 35 °C por 48 horas para ativar a fase leveduriforme e protocolo M38-A2 (CLSI, 2008b) para fungos filamentosos, visto que os fungos do gênero Sporothrix assumem forma dimórfica.
Serão feitas diluições de razão dois da AgNP em Caldo BHI (Brain and Hearth Infusion – Kasvi®) variando de 0,02-30 μg/mL e, em seguida, serão adicionados 50 μL do inóculo fúngico preparado a partir de suspensão em solução salina (1,5x108 UFC/mL) o qual será diluído em caldo BHI (1:20). Como controles serão utilizados o meio de cultivo, meio de cultivo acrescido do inóculo fúngico. Para os óleos essenciais serão testados nas concentrações de 2,25 a 72 mg/mL adaptada para o uso de fitofármacos (Cleff, et al. 2010). O antifúngico Itraconazol de uso veterinário (Cepav Pharma Ltda., São Paulo/SP, Brasil) foi utilizado como controle positivo e testado, conforme as diretrizes do documento. As colônias fúngicas serão contadas após o período de incubação, então será realizada uma avaliação sobre a variação da carga fúngica a fim de observar quais óleos essenciais apresentarão a maior variação negativa (queda na contagem), sendo assim maior eficácia no combate fúngico.
Aerossolização em câmara
O teste antifúngico de aerossolização em câmara será dentro de um fluxo laminar, onde um nebulizador acoplado a uma câmara contendo uma placa de testes, no qual se encontra a 15 cm da saída do aerossol produzido. Neste equipamento será nebulizada as diferentes soluções previamente preparadas tanto com os óleos isolados, como associados, sendo assim a dispersão por aerossol ficará em diferentes tempos, com diferentes compostos para observação posterior da atividade antifúngica dos compostos frente ao Sporothrix brasiliensis.
Citotoxicidade in vitro – Linhagens celulares e cultivo celular

A citotoxicidade das moléculas será avaliada em células da linhagem CRFK (Crandell Rees Feline Kidney) que serão adquiridas do banco de células do Laboratório de Vacinologia, do CDTec/UFPel. As células serão cultivadas em meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Sigma-Aldrich®) com a utilização de 180 μL de meio DMEM suplementado com 0,45% de glicose, e 20μL de (108 unidades formadoras de colônia/mL). Posteriormente, serão coletadas por tripsinização, centrifugadas e contadas em câmara de Neubauer, ajustando a concentração celular para 106 células/mL. Esta quantidade de células será suspendida no mesmo meio de cultivo incubadas a 37°C em atmosfera de 5% de CO2 por 48h. As moléculas serão adicionadas em diluições de razão dois (0,02-30 μg/mL) e as células incubadas novamente nas mesmas condições por 24h. Após o período de incubação será adicionado o corante Alamar Blue, o qual permitirá a leitura visual devido a alteração da cor, onde a coloração azul indicará morte celular (oxidada) e a cor rosa células viáveis.
Sabe-se que a bioinformática cria ferramentas computacionais para coletar, organizar e interpretá-los (WEAVER, J.; RANNIERY, T., 2020); os modelos de análise in silico permitem a predição do risco e perigo de uma substância química segundo sua estrutura molecular, assim como sua toxicidade (PERUQUETTI, 2020). Este método permite também a codificação precisa dos modelos, capazes de processar grandes quantidades de informação (BETTONI, 2022); prever efeitos colaterais indesejados em estágios iniciais, inteiração droga/alvo, sítios de metabolismo (SoMs). Além disso, a análise in silico possui vantagens em seu uso pois exige menor tempo de análise, reprodutibilidade, custos inferiores, e rapidez nos resultados (CASTRO, T. N. de; MOTA, M. D.; CAZEDEY, Edith C. L., 2022). Atualmente vem crescendo o uso deste método quantitativo em alternativo ao in vivo, e por vezes utilizados sendo como ferramentas complementares e substitutivas a experimentação animal (FISCHER, M. L.; FURLAN, A. L. D.; 2022).
Inicialmente, todas as informações químicas dos compostos serão obtidas na plataforma Pubchem®. Sendo assim serão utilizadas informações obtidas pela empresa que comercializa os óleos essenciais a serem utilizados neste trabalho, os principais componentes químicos do óleo essencial de orégano (Origanum vulgare L.) são o carvacrol e thymol; do óleo essencial de manjerona (Origanum majorana L.), o terpinen-4-ol, trans-sabinene hydrate, e γ-terpinene; já do óleo essencial de alecrim (Rosmarinus officinalis L.), o 1, 8-Cineole, α-pinene, e camphor.
Após coleta de dados na plataforma Pubchem® e DrugBank®, sendo os mesmos extrapolados para o AdmetSAR® e SwissADME® que é um banco de dados aberto, com sistema de pesquisa de texto e estrutura molecular, continuamente atualizado que coleta, organiza e gerencia dados de propriedades associados à absorção, distribuição, metabolização, excreção e toxicidade (ADMET) disponíveis na literatura publicada (GOMES et al., 2020).

Espera-se estabelecer uma formulação na qual haja combate/eliminação da infecção fúngica através de nebulização dos elementos estudados e pesquisados de maneira mais eficaz, ou tão eficaz quanto ao tratamento convencional utilizado nos felinos, afim de minimizar os efeitos adversos comparativamente ao tradicional, bem como promover uma recuperação mais rápida e eficiente dos pacientes, com diminuição do padrão inflamatório, da disseminação e do grau de acometimento dos tecidos e debilidade gerados pela esporotricose.