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Devido à grande variação das formulações disponíveis e o seu período de suplementação, muitas mulheres podem estar ingerindo uma quantidade de AF acima do recomendado. Ainda, não há um consenso sobre os efeitos da alta dosagem dessa vitamina no desenvolvimento dos recém-nascidos e poucos estudos avaliaram os efeitos da sobredosagem nas mães. No Brasil, o SUS disponibiliza gratuitamente apenas o suplemento de AF na dosagem de 5 mg/ dia (mais de 10 vezes acima do recomendado pela OMS), tornando urgente o conhecimento dos efeitos do AF nas mães e crianças, a fim de adequar, se necessário, a política de suplementação gestacional com AF. Assim, considerando a importância da realização da suplementação com AF durante o período gestacional, torna-se essencial o uso de pesquisa básica para se conhecer os mecanismos e efeitos envolvidos a longo prazo nos efeitos da suplementação em excesso dessa vitamina.

Cálculo Amostral
Para o cálculo de tamanho de amostra, tomou-se como base o estudo de Carletti et al., 2012; Pereira et al., 2007 para as análises comportamentais, o estudo de Asadi-Shekaari et al., 2009 para quantificação da densidade celular, o estudo de Elsner et al., 2013 para a quantificação da metilação global de DNA e o estudo de Neto et al., 2022 para o perfil inflamatório. Sendo assim, serão utilizados 14 animais por grupo para as análises comportamentais e 7 animais por grupo para as análises histológicas, bioquímicas e epigenética. O cálculo foi realizado por meio da ferramenta disponível em: http://calculoamostral.bauru.usp.br/calculoamostral/ta_comparacao_multipla_independentes.php.
Animais
Serão utilizados ratos machos (n=10) e fêmeas (n=21) da linhagem Wistar provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Pelotas (UFPEL). Os animais ficarão também alojados Biotério Central desta universidade e receberão ração e água ad libitum, sendo mantidos em ambiente climatizado (22o C), com ciclo claro / escuro de 12 horas. Após uma semana de ambientação, as ratas serão submetidas a exames colpocitológicos para detectar a fase do ciclo estral. As fêmeas serão colocadas em caixas individuais com machos assim que estiverem na fase receptível ao macho (proestro), assim permanecendo até o dia seguinte onde será realizado um novo exame colpocitológico confirmando ou não o acasalamento. Após o nascimento os filhotes ficarão em um número máximo de oito por ninhada até o desmame no dia pós-natal 21 (DPN 21).
As prenhas (n=7/grupo) serão então divididas em 3 grupos, de acordo com o tipo de dieta: 1) controles (ração padrão), 2) suplementadas com 2 mg/kg de AF, 3) suplementadas com 20 mg/kg de AF. Serão utilizados tanto filhotes machos quanto fêmeas, sendo assim serão 6 grupos experimentais da prole, totalizando 168 filhotes para todas as avaliações.
Após o desmame os filhotes serão mantidos em caixas padrão de biotério de polipropileno com dimensões de 41 x 34 x 17,8 cm, em um número máximo de 4 animais por caixa. Os testes comportamentais nos filhotes serão iniciados a partir do DPN 30.
O protocolo experimental será desenvolvido de acordo com as diretrizes da Lei Arouca (11.794/2008) e recomendações éticas do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA). Ainda, o projeto está submetido à Comissão de Ética no Uso de Animais da universidade (CEUA/UFPEL) para apreciação e avaliação.
Dietas
Todas as dietas serão baseadas no AIN-93, sendo isocalóricas e com 18% de proteínas, tanto nos controles quanto nos tratados (REEVES; NIELSEN; FAHEY, 1993). Durante o período gestacional, as ratas prenhes serão separadas nos 3 grupos de acordo com o grau de suplementação de AF: 1) controles, 2) suplementadas com 2 mg/kg de AF, 3) suplementadas com 20 mg/kg de AF. Após o desmame, todos os animais voltarão a dieta controle (DENIZ et al., 2018a, 2018b, 2021).
Testes comportamentais
Os testes comportamentais serão realizados nas mães após o desmame (DPN21). Nos filhotes os mesmos testes serão realizados a partir do DPN 30.
Teste de Campo Aberto (open field)
Para avaliação da atividade locomotora, os animais serão colocados em uma caixa de madeira de 50 X 50 X 39 (comprimento x altura x profundidade), com uma parede frontal de vidro. O campo aberto é dividido em 12 quadrantes iguais. Os animais são colocados no quadrante posterior esquerdo e observa-se a latência que levam para sair deste quadrante, o número de cruzamentos entre os quadrantes e número de rearings (elevações verticais), em um tempo de 300 segundos (NETTO; DIAS; IZQUIERDO, 1986).
Teste de Reconhecimento de Objetos
Será avaliada a memória de reconhecimento através do teste de reconhecimento de objetos de acordo com ENNACEUR; DELACOUR, 1988 adaptado por PEREIRA et al., 2008. O teste consiste em colocar os animais em uma caixa de vidro medindo 50 X 50 X 39 (comprimento x altura x profundidade), com dois objetos diferentes (A e B) por cinco minutos. Durante esse período é observado o tempo de exploração de cada objeto. Após, a exploração dos objetos o animal terá um descanso de cinco minutos e será recolocado na caixa com um novo objeto (C e B), onde se observa a exploração dos objetos por mais cinco minutos.
Teste do Labirinto em Cruz Elevado
Para a avaliação do comportamento tipo-ansioso, os animais serão submetidos ao teste do labirinto em cruz elevado (LCE). O aparato consiste em uma estrutura em forma de cruz com dois braços abertos e dois fechados por paredes laterais mantidos a um metro de altura do chão. Os animais serão colocados no quadrante central e terão 5 minutos para explorar o aparato, sendo avaliado o número de entradas e o tempo de permanência nos braços abertos e fechados, número de avaliações de risco e de explorações verticais.
Análises morfológicas
Coleta e preparação das amostras
Os animais serão anestesiados com Cetamina (90 mg/kg) e Xilazina (10mg/kg) por via intraperitoneal e submetidos à perfusão transcardíaca através do ventrículo esquerdo com solução salina 0.9% seguido de uma solução fixadora composta por 4% de paraformaldeído (PF) diluídos em 0,1M de tampão fosfato com pH 7,4. Após essa etapa, os encéfalos serão removidos e pós-fixados overnight na mesma solução fixadora utilizada para a perfusão e depois serão crioprotegidos em sacarose 15% e 30% diluída em tampão fosfato a 4ºC até submergirem. A próxima etapa é o congelamento dos encéfalos através de uma rápida imersão em isopentano e em seguida em nitrogênio líquido. Os encéfalos serão conservados em freezer -80°C até a realização das secções coronais (25 μm) em criostato.
Para as análises bioquímicas, animais que não tiverem realizado testes comportamentais serão decapitados em guilhotina. Logo após a decapitação, o encéfalo será removido e dissecado para a retirada das estruturas de interesse. A utilização do procedimento de decapitação, sem anestesia prévia, se faz necessária uma vez que os fármacos anestésicos podem interferir em parâmetros bioquímicos e moleculares, comprometendo desta forma os resultados da pesquisa.
Todos os procedimentos referentes à eutanásia e coleta de material biológico serão realizados por pesquisadores treinados para a execução das técnicas, seguindo o disposto no Art. 16 da Lei 11.764/08 e na Resolução Normativa nº 37 do CONCEA.


Imunohistoquímica
A técnica de imuno-histoquímica será realizada para avaliação de diferentes marcadores celulares do tecido nervoso: sinaptofisina, NeuN, GFAP e Iba1 (DENIZ et al., 2018a).
Nesta etapa após a coleta e criopreservação do encéfalo, as amostras contendo as regiões de interesse, serão seccionadas (25µm) com o auxílio de um criostato a -20C. Após a secção, as amostras serão lavadas em tampão fostato salino (PBS) e bloqueadas por 30 minutos em uma solução contendo 3% de albumina sérica bovina (BSA) diluídos em PBS Triton-X a 0,3% (PBS-Tx) em temperatura ambiente. Em seguida as secções serão incubadas overnight com o anticorpo primário diluído em PBS-Tx e BSA e mantidas em câmara fria (4º C) sob constante agitação. No dia seguinte, as secções serão lavadas em PBS e incubadas com o anticorpo secundário fluorescente em PBS-Tx por 2 horas em uma sala escura (temperatura ambiente), seguida de lavagem em PBS. Por fim, os cortes serão montados em lâminas, cobertos com meio de montagem e lamínula.
Western Blot
A técnica de Western Blot será realizada para quantificação dos seguintes marcadores inflamatórios na prole: IL-6 e TNF-a.
Resumidamente, nesta técnica serão realizadas extrações citosólicas e as amostras já processadas serão pipetadas nos poços de um gel de agarose para a separação das proteínas de acordo com o peso molecular. Após a separação será realizada a transferência das proteínas para uma membrana de nitrocelulose. Esta membrana será incubada com o anticorpo primário na sequência com anticorpo secundário. Após esse processo, é realizada a revelação e a quantificação da proteína. Actina ou b-tubulina serão usadas como controle endógeno (MIGUEL et al., 2019).
Avaliações epigenéticas nas ratas mães e na prole
Será realizada a avaliação da metilação global de DNA no hipocampo das ratas mães e da prole. A quantificação global de DNA será realizada em duplicata utilizando o MethylampTM Global DNA Methylation Quantification kit (Epigentek Group,NYC,EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O kit quantifica a razão do conteúdo de metil citosina em relação ao conteúdo total de citosina. O DNA das amostras será extraído e imobilizado em membranas, previamente tratadas para aumentar a afinidade ao DNA. A metilação do DNA será quantificada através da reação de ligação da enzima com o imunoconteúdo, usando o anticorpo 3-metilcitosina. A quantidade de DNA metilado é proporcional à densidade óptica (ELSNER et al., 2013).
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Será realizado o teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnoff. Quando os dados foram considerados normais, será utilizada a Análise de Variância (ANOVA), considerando a dieta e o sexo (no caso da prole) como fatores, seguida de teste de pos-hoc quando necessário. Se os dados foram não-paramétricos será utilizado o teste de Kruskal-Wallis seguido do teste de Mann-Whitney quando necessário. Serão considerados significativos os dados quando p<0,05.

Objetivo específico 1: Avaliar memória de reconhecimento e o comportamento do tipo ansioso nas mães e na prole após o desmame.
Meta 1: Identificar possíveis alterações comportamentais nas mães (n=7/grupo) e na prole (n=14/ grupo) em decorrência da suplementação com AF através de testes específicos realizados até o final do 5º trimestre de execução do projeto.
Objetivo específico 2: Avaliar a quantificação celular e metilação global de DNA no hipocampo das mães e na prole após o desmame.
Meta 2: Realizar a quantificação por meio de marcadores celulares pela técnica de imuno-histoquímica (n=7/grupo) e a quantificação da metilação global de DNA por ELISA (n=7/grupo) até o final do 6º trimestre.
Objetivo específico 3: Quantificar marcadores inflamatórios no hipocampo da prole após o desmame.
Meta 3: Realizar a quantificação de IL-6 e TNFa pela técnica de Western Blot (n=7/grupo) até o final do 6º trimestre.

Os resultados desse projeto serão divulgados em eventos científicos nacionais e internacionais, bem como serão submetidos para publicação em revistas científicas internacionais de alto impacto.