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O arroz é uma cultura de alta relevância para o Brasil e o mundo, e a seca é um dos fatores abióticos mais severos à agricultura. São escassas as fontes de tolerância a este estresse dentro do germoplasma de arroz brasileiro, havendo a necessidade de gerar nova variabilidade através de mutação e selecionar os genótipos mais promissores desenvolvidos. Neste contexto que a presente proposta irá atuar.
Dentro do contexto acadêmico, o projeto se trata de uma importante atividade de formação de pessoas, especialmente na área de pesquisa em fitomelhoramento, ao passo que o escopo da proposta é o enfrentamento de um importante problema da agricultura através do uso de diferentes e atuais métodos da área. O mesmo envolverá estudantes de graduação, mestrado e doutorado, do curso de Agronomia, durante 6 anos de execução, demonstrando a sua abrangência.
Para a Universidade Federal de Pelotas e Comunidade acadêmica, além da formação de pessoas, espera-se a geração de importantes resultados científicos e tecnológicos, os quais deverão ser compartilhados na forma de publicações. Ainda, a execução deste projeto permitirá que o grupo de pesquisa e a UFPel possam aumentar a inserção internacional. Finalmente, das linhagens geradas, se espera o desenvolvimento de pelo menos uma cultivar superior, a qual poderá ser registrada e protegida gerando um retorno financeiro para a instituição, além de se fazer em uma nova alternativa aos agricultores.

Material Vegetal
Sementes de arroz da cultivar BRS Pampeira serão irradiadas com radiação gama (Cobalto 60) nas doses de 250 e 300 Gy. Posteriormente, as sementes serão conduzidas em campos experimental para avanço de geração durante quatro anos.
Caracterização de famílias mutantes de arroz para tolerância à seca nos estádios de germinação e vegetativo
Famílias mutantes e a cultivar BRS Pampeira serão testadas quanto o estresse por seca em câmara de germinação (estádio de germinação) e em cultivo hidropônico sob condições de ambiente controlado (estádio vegetativo). A condição artificial de estresse hídrico será obtida com a preparação de uma solução de PEG 6000 (polietilenoglicol), com os potenciais osmóticos de 0 (controle), -0,025, -0,050, -0,075, -0,1, -0.5, -1,0 MPa.
Para a análise de germinação e primeira contagem de germinação, 50 sementes de cada genótipo serão colocadas para germinar em gerbox, em folha de papel especial para germinação, com quantidade de água equivalente a 2,5 vezes o peso do substrato, seguindo os critérios estabelecidos pelas Regras para Análise de Sementes (Brasil, 2009). Para a condição controle, será utilizada água destilada para embeber o papel de germinação e para a condição de estresse por seca será utilizada solução de PEG 6000 nos diferentes potenciais osmóticos descritos anteriormente. A germinação e primeira contagem de germinação das sementes serão realizadas aos 7 e 14 dias e expressa em porcentagem de plântulas normais obtidas. O delineamento experimental será inteiramente casualizado, em esquema fatorial (7 potenciais x 1000 famílias), com quatro repetições de 50 sementes.
A análise de genótipos tolerantes ao estresse por seca no estádio vegetativo será conduzida em sistema hidropônico. Nesse caso, plântulas apresentando comprimento de raiz uniforme (aproximadamente 5 mm), previamente germinadas em câmara de germinação, serão dispostas em telas de polietileno, adaptadas a recipientes plásticos de cinco litros, permitindo a sustentação das plântulas e o crescimento do sistema radicular no meio de cultivo, mantendo a raiz em contato permanente com a solução nutritiva padrão para arroz (Yoshida et al., 1976) e o respectivo tratamento (controle = apenas solução nutritiva; estresse por seca = solução nutritiva + PEG 6000). Os recipientes serão colocados no sistema hidropônico em banho-maria (25±1°C), com iluminação artificial controlada. As plantas serão analisadas aos 7, 14 e 21 dias, através da avaliação das variáveis: número de raízes; comprimento de raiz; matéria seca de raiz; volume de raiz; comprimento de parte aérea; matéria seca de parte aérea, inserção da primeira folha; comprimento da primeira folha e comprimento da segunda folha. O delineamento experimental será inteiramente casualizado, em esquema fatorial (7 potenciais x 1000 famílias) com três repetições de dez plantas.
Caracterização de famílias mutantes de arroz para tolerância à seca no estádio reprodutivo
De acordo com os resultados obtidos no screening para tolerância à seca nos estádios de germinação e vegetativo, serão selecionadas as famílias com melhor desempenho frente ao estresse para serem utilizadas no screening no estádio reprodutivo. O experimento será realizado em casa de vegetação, onde as famílias mutantes e a cv. BRS Pampeira serão testadas quanto o estresse por seca. No estudo serão empregadas as seguintes tensões de água: 0 Mpa, -0,025 Mpa, -0,050 Mpa, -0,075 MPa e -0,1 Mpa. Para o monitoramento da tensão de água do solo será utilizado micro tensiômetros instalados a 0,15 m de profundidade em cada unidade experimental. As plantas serão submetidas aos tratamentos de tensão de água no solo quando entrarem em estádio reprodutivo. Durante o período de estresse serão avaliadas a condutância estomática, a taxa fotossintética e a transpiração com auxílio do medidor de fotossíntese LCi portátil. A eficiência no uso da água será calculada com base na razão entre a taxa fotossintética e a taxa de transpiração.
As plantas também serão analisadas ao final do ciclo reprodutivo quanto à altura da planta; comprimento e largura da folha bandeira; comprimento da panícula principal; peso da panícula principal; comprimento do colmo; número de colmos/planta; número de panículas/planta, massa de 1000 grãos e caracteres de raízes como número de raízes; comprimento de raiz; matéria seca de raiz; volume de raiz. O delineamento experimental adotado será em blocos ao acaso, com três repetições, onde cada unidade de observação será composta por um recipiente (8 L) contendo três plantas.
Aplicação da técnica de TILLING em famílias mutantes de arroz visando à identificação de famílias tolerantes ao estresse por seca
Para a análise das famílias mutantes através da técnica de TILLING serão analisadas 1000 famílias, em 125 pools de oito famílias, para a presença de mutações no gene OsAHL1 - AT-hook content nuclear localized protein (LOC_Os11g05160), relacionado com a resposta ao estresse por seca em arroz. O DNA será extraído a partir de amostras foliares de cada pool de famílias, por meio do método de extração CTAB 2%, descrito por Saghai-Maroof et al. (1984). As reações de PCR dos pools de DNA e do controle (genótipo não mutado) serão realizadas em um volume final 13 µl contendo DNA, GoTaq Green Master Mix (Promega) e primer. Serão confeccionados primers específicos para a região de interesse. A amplificação e o tamanho dos produtos serão verificados por eletroforese em gel de agarose 2% corado com GelRed.
A detecção da mutação será realizada com o kit SURVEYOR®Mutation Detection Kits for Standard Gel Electrophoresis (Transgenomic) de acordo com as especificações do fabricante. Os produtos da digestão serão verificados por eletroforese em gel de agarose 2% corado com GelRed. Os pools cujas famílias apresentem bandas distintas à do produto de PCR do tipo selvagem possuem mutações no gene de interesse e, portanto, a identificação da família mutante dentro do pool será a etapa seguinte da análise, realizada pela amplificação do gene de interesse em plantas individualizadas.
Após a identificação da planta mutante será realizada a caracterização fenotípica do mutante em condições de estresse por seca e posteriormente será realizada uma análise de sequenciamento.
Mapeamento associativo em famílias mutantes quanto ao estresse por seca
Para a genotipagem em larga escala de SNPs será utilizada a tecnologia de sequenciamento de nova geração denominada genotipagem por sequenciamento (GBS, Genotyping by sequencing). O DNA genômico será enviado e analisado pelo Instituto de Diversidade Genômica da Universidade de Cornell (Buckler Laboratory). Neste instituto serão construídas as bibliotecas genômicas e conduzido o GBS. A análise de associação entre os marcadores SNPs e os caracteres de interesse para tolerância a seca será realizada pelo programa computacional TASSEL versão 3.0 standalone (Bradbury et al., 2007), utilizando-se o módulo Mixed Linear Model (MLM).

Resultados esperados: Espera-se a geração de linhagens superiores de arroz para a tolerância a seca e com manutenção de boas características agronômicas, além do estabelecimento de um eficiente método de avaliação e seleção de linhagens com superioridade para a tolerância à seca.

Metas:
- Indução de mutação nas sementes até 11/10/17
- Avanço de geração e avaliação fenotípica e genotípica das famílias mutantes geradas (processo contínuo ao longo dos 4 anos do projeto) – Cada ano é considerado uma sub-meta.
- Redação de relatórios e publicações até o final do projeto.