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-Produzir um genes sintéticos compreendendo epítopos imunogênicos das proteínas SsEno e Gp70 de Sporothrix spp.;
- Produzir antígenos nativos de S. brasiliensis;
-Padronizar o processo de expressão das proteínas recombinantes em Escherichia coli;
-Desenvolver um ELISA indireto para diagnóstico sorológico e estadiamento da infecção em felinos
-Imunizar camundongos BALB/c (Mus musculus) com formulações vacinais;
-Avaliar o potencial protetor das formulações frente a desafio com cepa viruleta de Sporothrix brasiliensis;
-Avaliar a resposta imune humoral e celular induzida pelas vacinas;
- Diagnosticar felinos com esporotricose e classificar as lesões cutâneas;
- Avaliar o efeito do tratamento com a vacina terapêutica associado ao itraconazol em felinos acometidos com esporotricose;
- Analisar clinicamente a redução das lesões no tratamento de esporotricose em felinos;

SUBPROJETO 1 – Desenvolvimento de um ensaio de ELISA para a detecção sorológica e estadiamento da esporotricose felina.

As proteínas recombinantes e nativas de S. brasiliensis serão selecionadas como antígenos para o teste de ELISA indireto. Para a construção das proteínas quiméricas serão utilizadas as sequências codificadoras (CDS) das proteínas SsEno e Gp70 depositadas no GenBank (ERS97971.1 e ERS98762.1, respectivamente) oriundas da cepa de Sporothrix brasiliensis. As sequencias de aminoácidos destas
proteínas serão analisadas pelas ferramentas e softwares de bioinformática. As proteínas recombinantes serão expressas em sistema procarioto. Proteínas nativas serão extraídas de isolados clínicos. As proteínas serão utilizadas como antígeno nos ensaios de diagnóstico sorológico.

ELISA Indireto
Serão utilizados soros de felinos provenientes do banco de soros do grupo ClinPet. Placas de microtitulação de poliestireno ELISA (Nunc Polysorp, Nalge Nunc International, Rochester, NY, EUA) serão sensibilizadas com proteína quimerica e nativas. As amostras se soro felino, comprovadamente positivos e negativos por meio do diagnóstico padrão ouro (cultura fúngica), serão diluídas 1: 100 em solução salina
tamponada com fosfato Tween 20 e adicionadas à placa. Em seguida, será adicionado conjugado de peroxidase IgG anti-felino (Sigma-Aldrich, EUA) e a reação será revelada pela adição de uma solução contendo OPD e peróxido de hidrogênio. A reação colorimétrica será interrompida pela
adição de 25 μL de 2 M H2SO4 por poço e a DO foi medida a 492 nm usando o leitor de ELISA VICTORTM X5 Multilabel Plate Reader (Perkin Elmer, EUA). O valor de corte será determinado como a DO média + dois desvios padrão do pool de soro felino (n = 47) diluído 1: 100 entre as amostras de soro desses animais, que foram negativas na cultura fúngica (Bomfim et al. 2005) . A avaliação do ELISA será realizada quanto à
sensibilidade (capacidade do ELISA em identificar as amostras de soro positivas, que também foram positivas na cultura fúngica) e especificidade (capacidade do ELISA em identificar as amostras de soro negativas, que também foram negativas na cultura fúngica) (Mariya et al. 2006). Esses experimentos serão realizados em triplicatas. Serão utilizadas amostras de soro controle de felinos saudáveis e de felinos com outras doenças infeciosas, exceto esporotricose leptospirose. Essas amostras foram compostas por soros de animais com sorologia positiva para o vírus da leucemia felina e para o vírus da imunodeficiência felina (FIV) A concordância entre os ensaios de cultura fúngica e ELISA será determinada usando o teste usando o teste Chi-quadrado (2) (Statistics, versão 8.0).
Somente a partir da execução e análise dos resultados obtidos nestas etapas será procedido o estudo em modelo murino e posteriormente em felinos (espécie alvo), conforme descrito nos subprojetos 2 e 3.

SUBPROJETO 2 – Imunoinformática aplicada ao desenvolvimento de vacina recombinante para esporotricose felina

Será realizado o cultivo de cepa virulenta diferentes formas da cepa Sporothrix brasiliensis previamente descrito (Fernandes et al., 2000), para o desafio dos animais experimentais. A forma de levedura será
obtida através de cultivo em meio Brain Heart Infusion (BHI) (Sigma-Aldrich, Brasil) a 37 °C (150 RPM) por 7 dias.
Desenvolvimento das proteínas quiméricas.
As proteínas SsEno e Gp70 foram selecionadas com base em revisão bibliográfica de trabalhos científicos. Para a construção da quimeras serão utilizadas as sequências codificadoras (CDS) das proteínas SsEno e Gp70 depositadas no GenBank (ERS97971.1 e ERS98762.1, respectivamente) oriundas da cepa de Sporothrix schenckii ATCC 58251 e S. brasiliensis. As sequencias de aminoácidos destas proteínas serão
analisadas pelas ferramentas e softwares de bioinformática.
As proteínas nativas serão extraídas, caracterizadas e quantificadas conforme protocolo previamente estabelecido.
Imunização dos camundongos
Serão utilizados camundongos BALB/c (Mus musculus) fêmeas e machos, pesando entre 15 e 20 gramas, com idade em torno de 6 a 8 semanas, procedentes do Biotério Central da UFPel. Antes de iniciar os ensaios, cada animal será identificado individualmente e então serão divididos aleatoriamente em cinco grupos de dez animais cada. Os animais serão imunizados por via subcutânea (SC) nos dias 0 e 21 com as vacinas e o respectivo controle negativo, os animais receberão três doses (via SC) com 21 dias de intervalo, contendo os antígenos recombinantes e nativos associadas a adjuvantes. Aos exatos 51 dias após a primeira dose os animais serão desafiados conforme descrito por (Fernandes et al., 2000) . Brevemente, o desafio será realizado por via subcutânea com 10 x 5 células de leveduras virulentas de Sporotrix brasiliensis em coxim digital. Os animais serão monitorados diariamente durante 40 dias para
acompanhar a progressão da doença. Após o término dos experimentos, os animais sobreviventes serão eutanasiados através da anestesia intratecal com pentobarbital 150 mg/kg. Amostras de lesões na pele, pulmões, fígado, baço e linfonodos serão removidas para acessar a carga do fungo, sua disseminação interna nos órgãos e realizar análises histopatológicas conforme protocolo previamente descrito. Em seguida as carcaçasserão encaminhadas para incineração.
Avaliação da resposta imune humoral
Amostras de sangue serão coletadas através da punção da veia submandibular antes de cada dose da vacina, desafio e antes da eutanásia para finalização do experimento. O soro será separado por centrifugação e armazenado à -20 °C até a sua utilização.
Avaliação da resposta imune celular
As formulações vacinais com melhor desempenho protetor frente a desafio letal serão utilizadas para imunização de um novo lote de animais.
Cerca de 21 dias após a aplicação da segunda dose os animais (10/grupo) serão eutanasiados por sobredose anestésica e o baço será coletado e macerado. . As células do baço (5x106/cavidade) serão cultivadas em meio DMEM acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB), em triplicata, utilizando placas de cultivo celular com 24 poços.
Todos os procedimentos serão submetidos ao CEUA/UFPel.

-Desenvolvimento de um ELISA indireto sensível e específico para o diagnóstico e o estadiamento da esporotricose em felinos;
-Obtenção das vacinas em diferentes formulações;
-Formulações vacinais avaliadas em camundongos através dos testes de proteção ao desafio;
-Formulações vacinais avaliadas quanto a resposta imune humoral e celular induzidas;
-Elucidação do tipo de resposta imune envolvido na indução de imunidade protetora;
-Avaliação de uma vacina terapêutica em felinos naturalmente acometidos pela esporotricose;
--Formação de recursos humanos altamente qualificados;