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Embora a bioatividade da Combeita já tenha sido demonstrada em matrizes vitrocerâmicas e compósitos cerâmicos, sua incorporação direta em cimentos endodônticos ainda é pouco explorada. Estudos anteriores mostraram que essa fase pode melhorar a viabilidade celular, a atividade osteogênica e o comportamento antimicrobiano sem comprometer a integridade estrutural (AMARAL et al., 2023; CABAL et al., 2014; OLIVEIRA et al., 2020). No entanto, não há relatos detalhados sobre o efeito da incorporação de Combeita cristalina ao MTA em propriedades-chave como resistência mecânica, solubilidade, sorção, liberação iônica e atividade antimicrobiana contra E. faecalis. Além disso, os mecanismos estruturais associados à hidratação e a possível recondensação de fases silicáticas não cristalinas atuando como seladoras de defeitos não têm sido discutidos em sistemas de MTA enriquecidos com Combeita, representando uma lacuna relevante na literatura atual.

Metodologia (Resumo)
Este estudo in vitro empregará um delineamento experimental randomizado, controlado e cego para avaliar a influência da incorporação de diferentes concentrações de Combeita no Agregado de Trióxido Mineral (MTA).

Síntese da Combeita
A Combeita será sintetizada via rota Sol-Gel, com modificações. Inicialmente, ácido silícico será obtido por troca iônica e, subsequentemente, misturado com nitrato de cálcio e nitrato de sódio em quantidades estequiométricas. A mistura será agitada até a gelificação, seguida por secagem a 100°C por 48 horas e calcinação a 800°C por 5 horas. O material calcinado será moído e peneirado para tamanho de partícula inferior a 75 µm. As fases cristalinas serão confirmadas por difração de raios X (XRD) e a composição química por espectroscopia de energia dispersiva (EDS).

Preparação dos Cimentos Experimentais
O pó de Combeita sintetizado será fisicamente misturado com MTA comercial (Angelus, Londrina, Brasil) em proporções de 5%, 10% e 20% em peso para formar os grupos experimentais: MTA-5C, MTA-10C e MTA-20C, respectivamente. Um grupo controle (MTA-0C), sem Combeita, será utilizado em todos os testes, de acordo com as informações fornecidas pelo fabricante. Clorexidina a 2% (CHX) será utilizada como controle positivo em ensaios antibacterianos. A randomização será realizada utilizando tabelas de números aleatórios, garantindo igual probabilidade de alocação de grupo e cegamento. Este procedimento será aplicado a todos os testes conduzidos.

Preparação do Eluato e Cultivo Celular
Espécimes cilíndricos de cimento (6 mm x 1 mm) serão preparados em um molde de metal bipartido e imersos em meio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) sem soro fetal bovino, na proporção de 3 cm
2/mL. Após incubação, os eluatos serão coletados, filtrados (0,22 µm) e utilizados para ensaios biológicos. Células da polpa dentária humana (HDPCs), conhecidas por seu comportamento semelhante a células-tronco mesenquimais, serão cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e antibióticos. Os ensaios serão conduzidos seguindo protocolos éticos e de biossegurança.

Ensaios a Serem Realizados
Os cimentos experimentais serão caracterizados pelas seguintes análises:

Viabilidade Celular (Ensaio MTT): HDPCs serão semeadas em placas de 96 poços e incubadas com eluatos dos cimentos experimentais. Após cada período de incubação de 3 dias, solução de MTT (0,05% de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio brometo) será adicionada e incubada. Cristais de formazan serão dissolvidos em DMSO (Dimetilsulfóxido), e a absorbância será medida a 570 nm utilizando um leitor de microplacas. Os resultados serão expressos como porcentagem do controle.

Atividade da Fosfatase Alcalina (ALP): Após o período de incubação de 10 dias com eluatos dos cimentos experimentais (n=5), as HDPCs serão lisadas e a atividade da ALP medida utilizando um kit comercial (Labtest Diagnóstica, Lagoa Santa, Brasil), baseado na hidrólise de monofosfato de timolftaleína. A absorbância será medida em um leitor de microplacas a 590 nm. Os resultados serão normalizados pelo conteúdo total de proteínas.

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV): A morfologia das superfícies fraturadas dos cimentos será analisada utilizando um microscópio eletrônico de varredura com canhão de elétrons de emissão de campo (MIRA, Tescan). Três espécimes serão recobertos por sputtering com ouro e imaginados sob alto vácuo. Porosidade e morfologia da fase cristalina serão documentadas.

Formação de Nódulos Mineralizados (Análise Qualitativa): A mineralização da matriz extracelular será avaliada por coloração com Alizarina Vermelha S após 14 dias de cultura celular (n=5). As amostras serão lavadas com solução salina balanceada de Hank's e fixadas com formaldeído a 4%. Subsequentemente, as amostras serão coradas com solução de Alizarina Vermelha S a 2% (pH 4.2) e incubadas por 20 minutos. O excesso de corante será removido e a presença e distribuição de nódulos mineralizados ricos em cálcio serão avaliadas qualitativamente utilizando microscopia óptica (Axio Observer A1, Carl Zeiss, Germany).

Medida de pH: Para avaliar o potencial alcalinizante dos materiais, o pH do meio de imersão será monitorado ao longo do tempo. Para cada teste, 100 mg de material em pó com tamanho de partícula inferior a 70 µm serão imersos individualmente em 10 mL de água ultrapura e armazenados em tubos hermeticamente fechados a 37°C. As medições de pH serão realizadas utilizando um medidor de pH digital calibrado equipado com um sistema de agitação interna (Stabino, Particle Metrix GmbH, Germany). Os valores de pH serão registrados individualmente para cada ponto de tempo e material.

Sorção e Solubilidade em Água: Dez espécimes em forma de disco serão utilizados para determinar a sorção e solubilidade em água, de acordo com a ISO 4049:2000. Os espécimes de cada material (n=10) serão preparados utilizando um molde de metal bipartido com espessura de 1 mm e diâmetro de 6 mm. Os espécimes serão pesados após 24 horas até que uma massa inicial estável (m1) seja alcançada. Em seguida, serão armazenados em água destilada (1 mL por espécime) a 37°C por uma semana (m2) e pesados novamente após a remoção da solução até atingirem uma massa final estável (m3). A sorção e a solubilidade serão calculadas utilizando fórmulas padrão.

Resistência à Compressão e Análise de Weibull: Este teste será realizado seguindo a ADA 96/2012. Espécimes cilíndricos (6 mm de altura x 4 mm de diâmetro) serão preparados e armazenados a 37°C. O teste de compressão será realizado utilizando uma máquina de teste universal (DL500, EMIC, Brasil) a uma velocidade de travessia de 0,5 mm/min. A carga máxima de falha será registrada, e a resistência à compressão será calculada em MPa. Um tamanho de amostra de n=20 será utilizado. A análise de distribuição de Weibull será aplicada para determinar a resistência característica e o módulo de Weibull.

Escoamento: O teste de escoamento será realizado de acordo com a ISO 6876:2012 e ADA 57:2021. Aproximadamente 0,05 mL de cimento (n=5) serão aplicados entre duas placas de vidro (40x40mm), e um peso de 100g será colocado sobre as placas. Duas determinações em milímetros serão feitas para cada amostra para determinar a extensão do escoamento do material.

Ensaios Antibacterianos: Cepas padrão de Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Enterococcus faecalis (ATCC 29212) serão utilizadas. As bactérias selecionadas serão cultivadas individualmente por 24 horas em placas de ágar BHI (Brain Heart Infusion) e MHA (Mueller-Hinton agar), mantidas em condições aeróbicas a 37°C. Em seguida, as bactérias serão semeadas novamente em infusão de ágar BHI.


Teste de Difusão em Ágar (ADT): Espécimes (6 mm x 1 mm, n=3) serão desinfetados por radiação UV por 30 minutos a 37°C. Em seguida, serão colocados em meio ágar BHI contendo inóculo bacteriano (E. faecalis) e ágar Mueller-Hinton (S. aureus) previamente semeado em uma concentração de 0.5 MacFarland. O grupo controle negativo será CHX 2%, e o controle positivo será a suspensão de E. faecalis e S. aureus. Após 24 horas de incubação, as zonas de inibição do crescimento microbiano ao redor das amostras serão medidas e registradas. Os diâmetros das zonas de inibição serão medidos em milímetros utilizando um paquímetro digital.

Teste de Contato Direto Modificado (MDCT): Espécimes (n=6) serão colocados em uma placa de 96 poços, com cada poço recebendo uma amostra e 100 µL de suspensão bacteriana, resultando em um volume total de 200 µL por poço. Os discos serão incubados a 37°C em condições aeróbicas por 24 horas em caldo BHI. Poços controle contendo o mesmo volume de suspensão bacteriana, mas sem as amostras de teste, serão incluídos para avaliar o crescimento bacteriano. Controles negativos consistirão de materiais incubados em um meio estéril sem inoculação bacteriana. Após a incubação, o conteúdo de cada poço será agitado utilizando um agitador mecânico por 10 minutos. Uma alíquota de 100 µL será então coletada de cada poço e transferida para solução salina para diluição em série. Diluições em série de dez vezes serão realizadas. Subsequentemente, as amostras serão plaqueadas em ágar BHI em cinco seções, com três alíquotas (20 µL cada) de cada diluição. As placas serão incubadas a 37°C em condições anaeróbicas por 24 horas. O teste será conduzido em triplicata, e após a incubação, o número de unidades formadoras de colônias (CFU/mL) será determinado. Para garantir a reprodutibilidade, todo o procedimento experimental será repetido três vezes.

Análise Estatística
Os dados serão analisados utilizando ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Tukey, com significância definida em p≤0.05. Esses procedimentos estatísticos serão realizados utilizando SigmaPlot 13.0 (Systat Inc., USA) para as seguintes metodologias: Viabilidade Celular (Ensaio MTT), Atividade da Fosfatase Alcalina (ALP), Sorção e Solubilidade em Água, Escoamento, Teste de Difusão em Ágar (ADT) e Teste de Contato Direto Modificado (MDCT). A análise de distribuição de Weibull será aplicada para determinar a resistência característica e o módulo de Weibull a partir do teste de resistência à compressão. Os parâmetros de Weibull serão calculados utilizando o método de estimativa de máxima verossimilhança. A Microscopia Eletrônica de Varredura, Formação de Nódulos Mineralizados e pH serão avaliados por análise qualitativa

Indicadores, Metas e Resultados Esperados
Baseando-se nos resultados já obtidos e descritos, o projeto visava os seguintes indicadores, metas e resultados esperados:

Indicador: Propriedades Estruturais e Mecânicas Aprimoradas.

Meta: A adição de Combeita promoverá a formação de uma microestrutura mais homogênea, com poros menores e bem distribuídos, selando microdefeitos e, consequentemente, aumentando a resistência à compressão e reduzindo a solubilidade.
Resultado Esperado: A adição de Combeita promoverá a formação de uma microestrutura mais homogênea, com poros menores e bem distribuídos, associada a uma fase vítrea que selará microdefeitos. Essas mudanças aumentarão a resistência à compressão nos grupos experimentais (MTA-5C, MTA-10C, MTA-20C). Os valores de solubilidade apresentarão uma tendência de diminuição à medida que a concentração de Combeita aumentar.


Indicador: Melhoria das Propriedades Físico-Químicas.

Meta: A incorporação de Combeita resultará em uma elevação progressiva e sustentada do pH do meio, sem comprometer a sorção.
Resultado Esperado: Apesar da menor solubilidade, os grupos com 10% e 20% de Combeita apresentarão um aumento progressivo e sustentado do pH.
Indicador: Biocompatibilidade e Atividade Bioativa Mantidas/Aprimoradas.

Meta: A Combeita não comprometerá a viabilidade celular nem a atividade da fosfatase alcalina, mantendo o potencial de formação de tecido duro.
Resultado Esperado: Os grupos com 10% e 20% de Combeita mostrarão maior viabilidade celular sem comprometer a atividade da fosfatase alcalina. Na formação de nódulos mineralizados, a morfologia dos depósitos será semelhante, independentemente da concentração de Combeita.

Indicador: Eficácia Antimicrobiana Aumentada.

Meta: A adição de Combeita intensificará a atividade antimicrobiana do MTA de forma dose-dependente contra Enterococcus faecalis e Staphylococcus aureus.
Resultado Esperado: A atividade antimicrobiana será intensificada de forma dose-dependente, com o grupo MTA-20C demonstrando a redução bacteriana mais eficaz e duradoura, especialmente no teste de contato direto.
Indicador: Potencial Clínico Elevado.

Meta: A combinação das propriedades aprimoradas tornará o material uma alternativa promissora para a endodontia regenerativa e ambientes infectados.
Resultado Esperado: A incorporação de Combeita ao MTA melhorará de forma integrada o desempenho mecânico, a estabilidade química, a liberação iônica, a biocompatibilidade e a eficácia antimicrobiana do material. A combinação dessas propriedades tornará essa estratégia uma alternativa promissora para atender às exigências clínicas da endodontia regenerativa contemporânea e de ambientes infectados.