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Recentemente, estudos tem demonstrado que diversos protozoários tais como Leishmania (Atayde et al., 2015), Giardia, Trichomonas vaginalis (Twu et al., 2013) incluindo Toxoplasma gondii (Li et al., 2018) liberam pequenas vesículas extracelulares (VEs) conhecidas como exossomos que contêm padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) caracterizados pela presença de material genético e proteínas relacionadas a indução de respostas imunes (Coakley et al., 2015).
Os exossomos, são reconhecidos por pequenas vesículas em escala nanometrica (40 a 100 nm de diâmetro) secretadas pela maioria dos tipos de células capazes de transferir moléculas bioativas entre as células desempenhando papéis cruciais na comunicação intercelular, cuja obtenção e purificação se dá a partir de produtos secretados e excretados de parasitas através da manutenção de parasitos in vitro seguido de sucessivas etapas de ultracentrifugação (Mohsin et al., 2019).
Beauvillain e colegas (2007) demonstraram que camundongos vacinados com exossomos derivados de células dendríticas carregados com antígenos de T. gondii induziram fortes respostas celulares e humorais, conferindo assim proteção contra a toxoplasmose congênita em sua prole. Durante a infecção, o parasita libera numerosas moléculas denominadas antígenos excretados/secretados de T. gondii (TgESAs) que ajudarão no processo de invasão e sobrevivência do parasita, através de imunomodulação, e parecem ser os primeiros alvos de reconhecimento pelo sistema imune do hospedeiro.
Desta forma, surge a caracterização e justificativa desta pesquisa; já que o estudo de exossomos derivados de T. gondii são importantes não apenas para protocolos terapêuticos atrelados a neurotoxoplasmose, mas também com como como alvos terapêuticos candidatos em doenças neurodegenerativos e neuro inflamatórias tais como
a Doença de Alzheimer (DA).
Dado que a micróglia monitora continuamente o parênquima cerebral circundante para detectar alterações na função cerebral e está envolvida no controle da excitabilidade neuronal, atividade sináptica, neurogênese e depuração de células apoptóticas no cérebro adulto, assim, a hipótese que pretende responder é: “Poderiam exossomos derivados de T. gondii ativar células microgliais?”

Este estudo utilizará cepa não cistogênica RH de T. gondii proveniente da parasitoteca da pesquisadora mantida em nitrogênio líquido. Os taquizoitos serão descongelados através de protocolos específicos e mantidos em cultivo de células da linhagem VERO (BCRJ 0245), gentilmente cedidas pelo Laboratório de Enzimologia Toxicológica da UFSM, cultivadas na densidade 1x107 taquizoítos suplementado com 2,5
μg/mL de gentamicina e 10% de soro fetal bovino (SFB) em pH 7,2 e acondicionadas em estufa a 37 °C e 5% de CO2. As culturas serão observadas diariamente, com auxílio do microscópio invertido, até a completa lise das células e liberação dos taquizoítos no meio de cultura.
Os taquizoitos liberados no sobrenadante das culturas de células VERO serão recolhidos em tubos cônicos de 15 mL e centrifugados a 400 rpm durante 10 minutos, para remover os restos celulares. O sobrenadante, contendo os parasitas, será descartado e o sedimento, será ressuspenso em 5 mL de PBS estéril. Para eliminar completamente o meio de cultura e garantir a purificação de vesículas extracelulares apenas dos parasitas e não das células VERO, a suspensão será lavada (três vezes) com 5 mL de PBS estéril e centrifugada a 3.000 rpm por 10 minutos. Para que a liberação de EVs, os parasitas serão incubados durante 2 horas a 37 °C em estufa de CO2 a 5%. Ao final da incubação, a suspensão será centrifugada por 10 minutos a 3.000 rpm e o sobrenadante filtrado utilizando membrana de 0,22 μm, para a purificar as EVs. A solução será estocada a -20°C até o momento do uso.
As culturas de células BV-2 serão pré-incubadas com o peptídeo b-amilóide (Ab ,500hM, Sigma Aldrich) por 30 minutos antes da adição de exossomos de T. gondii a fim de mimetizar o modelo de Doença de Alzheimer. A taxa de proliferação celular será medida através da incubação com 50 μmol/L de 5-bromo-2 desoxiuridina (BrdU- Sigmam Aldrich), um análogo da timidina que se incorpora ao DNA durante a fase S do ciclo celular e pela marcação do DNA total com iodeto de propídio (IP) durante 30 minutos (CAPPELLA et al., 2008). A morte celular será avaliada através da adição do reagente DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol). As células serão fixadas em lâminas utilizando 4% de paraformaldeído (PFA) durante 20 min e, em seguida, bloqueadas/permeabilizadas em 3% de SFB, 0,1% de Triton X-100 durante 20 min. As imagens serão capturadas com câmera digital Nikon acoplada a um microscópio de fluorescência (Axiovert 200, Zeiss,
Laboratório Veterinária).

1. Isolar, caracterizar e purificar exossomos de T. gondii;
2. Avaliar os efeitos diretos de exossomos T. gondii em células microgliais;
3. Elucidar o potencial imunomodulador der exossomos de T. gondii na micróglia ativada;
4. Determinar a taxa de proliferação/morte celular induzidas por exossomos de T.gondii;
5. Entender o mecanismo supressivo das respostas imunes elicitadas por exossomos de T. gondii;
6. Explorar o potencial supressivo das proteínas do parasito para induzir a imunomodulação;