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A pecuária leiteira enfrenta diversos desafios, especialmente durante o período de transição, que compreende aproximadamente as três semanas que antecedem e as três semanas que sucedem o parto. Nesse intervalo, a vaca passa de gestante a lactante, vivenciando intensas alterações metabólicas, endócrinas e nutricionais, que frequentemente comprometem sua produção, fertilidade, saúde e bem-estar (Serrenho et al., 2021). Segundo LeBlanc (2010), até 50% das vacas leiteiras apresentam pelo menos uma enfermidade nesse período.
Dentre as doenças metabólicas mais relevantes nesse contexto, destaca-se a hipocalcemia, caracterizada pela queda dos níveis de cálcio no sangue. Essa condição pode se manifestar de forma clínica ou subclínica (Arechiga-Flores et al., 2022). Atualmente, a forma subclínica é motivo de maior preocupação, por não apresentar sinais visíveis, sendo silenciosa e de difícil detecção (Serrenho et al., 2021). Ela é definida por concentrações de cálcio total (tCa) inferiores a 2,15 mmol/L e de cálcio ionizado (iCa) inferiores a 1,0 mmol/L (Goff, 2018; Meléndez et al., 2022). Sua incidência é elevada, atingindo até 57% das vacas com duas ou mais lactações (Reinhardt et al., 2011). Geralmente, a hipocalcemia ocorre logo após o parto, devido à súbita elevação na demanda por cálcio para a produção de colostro (2,1 g/L) e leite (1,1 g/L) (Goff, 2008; Goff, 2014; Barraclough et al., 2020).
Outro aspecto preocupante é que a hipocalcemia está frequentemente associada a outras doenças metabólicas, sendo considerada uma condição predisponente para cetose (Rodríguez et al., 2017), deslocamento de abomaso (Rodríguez et al., 2017; Martinez et al., 2018) e distúrbios uterinos (Martinez et al., 2012; Neves et al., 2018). De acordo com Barraclough et al. (2020), vacas com níveis de cálcio ≤2,1 ou ≤2,2 mmol/L na primeira semana pós-parto apresentam maior risco de descarte nos primeiros 60 dias de lactação.
Isso se deve, em parte, ao fato de que o cálcio é essencial para a função dos neutrófilos, células fundamentais no controle da inflamação e na resposta a infecções (Lundqvist-Gustafsson et al., 2000; Galvão, 2012; Serrenho et al., 2021). Martinez et al. (2014) demonstraram que vacas com hipocalcemia subclínica induzida apresentam menor capacidade de fagocitose. Com isso, a hipocalcemia se configura como uma das doenças mais onerosas da pecuária leiteira. Estimativas de Liang et al. (2017) apontam um custo médio de US$ 246,23 ± 52,25 por caso não fatal e US$ 1.192,40 em casos que resultam em morte ou descarte do animal. Diante desse cenário, torna-se imprescindível o investimento em estratégias de prevenção.
A abordagem preventiva mais amplamente adotada é o uso de sais aniônicos (cloretos e sulfatos) na dieta pré-parto. Esses sais reduzem a diferença cátion-aniônica da dieta (DCAD), induzindo uma leve acidose metabólica, a qual aumenta a sensibilidade dos receptores do hormônio paratireoideano nos ossos e rins. Isso resulta em maior mobilização do cálcio ósseo, reabsorção renal e absorção intestinal, elevando as concentrações de cálcio circulante (Goff, 2014). No entanto, o grau dessa acidose deve ser monitorado por meio do pH urinário, que deve se manter entre 5,5 e 6,5 durante o período pré-parto para vacas Holandesas (Santos et al., 2019).
Segundo Berwal et al. (2020), o uso de sais aniônicos, além de prevenir a hipocalcemia, promove efeitos positivos sobre o metabolismo, saúde pós-parto e na produção de leite. Contudo, a maioria dos produtos aniônicos disponíveis atualmente não é palatável, o que compromete a aceitação e reduz o consumo alimentar (Stout et al., 1972; Oetzel & Barmore, 1993). Para amenizar esse problema, alguns produtos recebem aromatizantes, mas a efetividade dessa estratégia é limitada. A redução do consumo da dieta pré-parto pode agravar o balanço energético negativo (BEN), predispondo o animal a outras doenças do período de transição (Van Knegsel et al., 2005). Consequentemente, mesmo em países com elevado nível tecnológico na pecuária leiteira, como os Estados Unidos, a adesão ao uso de sais aniônicos no pré-parto ainda é inferior a 80% (Lawton et al., 2016). No Brasil, na região de Castro/PR, essa taxa é inferior a 94% (Askel, 2020). Ou seja, embora se reconheça a eficácia dessa estratégia, a baixa palatabilidade dos produtos limita sua adoção. Isso evidencia a necessidade de alternativas mais palatáveis e igualmente eficazes. Com isso, o objetivo deste projeto será validar um suplemento aniônico palatável para vacas leiteiras no pré-parto.

Ensaio 1: in vitro
Serão utilizadas amostras de dieta totalmente misturada (TMR), composta por silagem de milho, pré-secado de azevém e concentrado comercial. As amostras serão secas em estufa com circulação de ar forçado a 55°C por 72 horas, para determinação do teor de matéria seca (MS), e posteriormente moídas em moinho tipo Wiley, com peneira de 1 mm. Para o ensaio, serão pesados 30 g de amostra, divididos em seis sacos de poliéster com 2,5 g cada. Os sacos serão previamente secos a 105°C por 2 horas e pesados em balança analítica de precisão.
Dois grupos experimentais serão avaliados: o grupo Controle (TMR sem adição do suplemento) e o grupo Tratamento (TMR com adição do protótipo aniônico na dose de 1% da MS). Cada grupo será incubado separadamente, utilizando seis sacos por grupo, sendo retirados dois sacos em três diferentes momentos de incubação: 12h, 24h e 36h. Novas rodadas serão iniciadas a cada tempo de incubação, de modo a evitar a entrada de oxigênio e a redução da concentração do produto no meio.
O fluido ruminal será coletado por fístula de ovinos canulados, mestiços das raças Texel e Corriedale, com aproximadamente três anos de idade. A coleta será realizada imediatamente antes de cada rodada experimental, totalizando 1,2 L por rodada. O conteúdo será filtrado em camadas de gaze para remoção de partículas grandes, mantido sob constante gaseificação com CO₂ e pré-aquecido a 39°C em banho-maria, para preservar a viabilidade da microbiota ruminal. A incubadora in vitro utilizada será a do Laboratório de Nutrição Animal do Nupeec Hub, equipada com quatro cubas de fermentação de 2 L. Cada recipiente receberá seis sacos com 2,5 g de amostra (totalizando 15 g). O meio de fermentação desenvolvido conforme descrito por Martins et al. (2019). Serão coletadas amostras do líquido de fermentação no tempo 0h e após cada tempo de incubação (12h, 24h e 36h) para determinação do pH em peagâmetro previamente calibrado e avaliação microscópica da viabilidade de protozoários.
A viabilidade dos protozoários ruminais será avaliada qualitativamente por microscopia óptica, a partir de lâminas preparadas com líquido ruminal coletado em cada período. Para avaliação da digestibilidade da matéria seca (DMS), após cada tempo de incubação, os sacos serão retirados, lavados com água destilada até completa remoção de resíduos solúveis, secos em estufa a 105°C por 12 horas e pesados. Para determinar a digestibilidade da fibra em detergente neutro (dFDN), a FDN será determinada nas amostras antes da incubação e nos resíduos de cada saco após incubação, utilizando o método de Van Soest modificado com detergente neutro.
Os dados serão analisados por meio do programa estatístico R 4.2.1 (R Core Team, 2022, Viena, Áustria). As variáveis serão analisadas quanto à normalidade por meio do teste de Shapiro-Wilk. Os resultados que não apresentarem normalidade serão analisados pelo teste de Kruskal-Wallis. Para variáveis numéricas com distribuição normal será realizada análise de variância de duas vias, considerando o tempo de incubação, os grupos e a interação entre esses fatores. Além disso, será realizado o teste de Fisher para variáveis categóricas. Os valores serão considerados significativos quando p < 0,05.
Ensaio 2: in vivo
Serão selecionadas 20 vacas multíparas prenhes não lactantes, entre segunda e quarta lactação, que receberão dieta pré-parto formulada para atender às exigências nutricionais da categoria de acordo com o NASEM (2021), com adição de um produto aniônico, durante 21 dias antes do parto. Os animais serão divididos aleatoriamente em 2 grupos: Grupo Tratamento (n=10), que irá receber um suplemento aniônico palatável na dose de 500 mL/dia, contendo cerca de 35% de sais aniônicos; Grupo Controle Positivo (n=10), que receberá o produto aniônico comercial na dose de 300 g/dia (BCAD -100 mEq/kg), ambos produtos aniônicos serão adicionados à dieta total. O pH da urina será verificado no pré-parto através do phmetro de bancada (Tecnopon, PA-210- SP, Brasil), sendo analisado de 3 em 3 dias a partir do início da suplementação.
A avaliação do consumo e comportamento alimentar dos animais ocorrerá a partir dos 21 dias antes do parto, por um período de 24 horas/dia, de forma automática e individualizada, através de alimentadores eletrônicos (Modelo AF 1000 Ponta Agro®, Betim, Brasil), o qual avaliará a quantidade de consumo (kg/dia), tempo de consumo (min/dia), visitas ao cocho com e sem consumo (nº visitas/dia).
As coletas de sangue de ambos os grupos, serão coletadas nos dias -21, -18, -15, -12, -9, -6, -3 em relação à data prevista para o parto, e após o parto nas horas 0, 12, 24, e nos dias 2, 3, 4, 5, 7, 10 e 14 dias após o parto. Serão realizadas por punção do complexo arterio-coccígeo utilizando o sistema Vacutainer (BD Diagnostics, São Paulo, Brasil) nos tubos com citrato de potássio, heparinizado e sem anticoagulante. Após, as amostras serão centrifugadas a 2250 x g por 15minutos à temperatura de 24±3ºC para a obtenção de soro e plasma. Posteriormente, as amostras serão armazenadas à temperatura de -20°C até o momento das análises.
Serão analisadas as concentrações de cálcio total, magnésio, albumina, fósforo, glicose, beta-hidroxibutirato (BHB), ácidos graxos livres (AGL), haptoglobina e paraoxonase-1 utilizando kits comerciais (Labtest Diagnóstica S.A., Brasil), por calorimetria, através do equipamento bioquímico automático (Lambax Plenno - Labtest Diagnóstica S.A., Brasil). O sangue heparinizado, será utilizado para mensuração, logo após a coleta, para avaliar o pH, pressão de dióxido de carbono, pressão de oxigênio, total de dióxido de carbono, bicarbonato, excesso de bases, saturação de oxigênio, hematócrito, hemoglobina, sódio, potássio e cálcio ionizado utilizando o bioquímico portátil i-STAT (Abbott Point of Care lnc., IL, EUA).
Durante o pré-parto, diariamente os animais serão avaliados clinicamente. A partir do parto, os animais serão monitorados quanto à ocorrência das seguintes doenças: hipocalcemia, retenção de placenta, mastite, cetose, metrite e endometrite. Quanto ao exame clínico geral, serão avaliadas as frequências cardíaca e respiratória, movimentos ruminais, temperatura retal, coloração de mucosas e grau de hidratação (Rosemberger, 1993), além da realização do exame específico de cada sistema, das enfermidades mencionadas acima. Ainda, durante os 14 dias pós-parto, será monitorada produção diária de leite, bem como, avaliada a qualidade do colostro por meio de refratometria de Brix (BEL RHB 0-10ATC, Biovera, Ramos, Brasil). Ademais, serão realizadas pesagens dos animais durante os mesmos momentos de coleta de sangue, para esta análise, será estimada por meio de fita métrica de pesagem bovina, posicionada posterior à articulação escápulo-umeral, para determinar a circunferência do perímetro torácico (Heinrichs et al., 1992).

Os dados serão analisados por meio do programa estatístico R 4.2.1 (R Core Team, 2022, Viena, Áustria). As variáveis serão analisadas quanto à normalidade por meio do teste de Shapiro-Wilk. Os resultados que não apresentarem normalidade serão analisados pelo teste de Kruskal-Wallis. Para variáveis numéricas com distribuição normal será realizada análise de variância de duas vias, considerando grupo, momento da coleta e a interação entre eles. Ainda, para comparação de médias será utilizado o teste de Tukey. Além disso, será realizado o teste de Fisher para variáveis categóricas, Odds Ratio para verificar a chance de ocorrência de doenças, correlação de Pearson e regressão linear para identificar associações entre as variáveis analisadas. Os valores serão considerados significativos quando p < 0,05.