Nome do Projeto
Avaliação e caracterização da proteína ErpY-like de Leptospira interrogans em imunoensaios
Ênfase
PESQUISA
Data inicial - Data final
16/12/2015 - 01/10/2019
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas - Microbiologia - Microbiologia Aplicada
Resumo
A leptospirose é uma antropozoonose causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira. É caracterizada como uma doença infecciosa grave de ampla distribuição mundial. A busca por uma vacina efetiva que previna esta infecção se justifica, pois as vacinas atuais são compostas por bactérias inativadas e não estimulam proteção cruzada contra diferentes sorovares. O estudo de proteínas presentes exclusivamente em leptospiras patogênicas e expressas por cepas virulentas da bactéria, tem resultado na identificação de novos alvos para o desenvolvimento de vacinas e testes diagnósticos. Neste sentido, o estudo do potencial imunogênico e antigênico da proteína de Leptospira interrogans associada à membrana celular, LIC11966, posteriormente denominada ErpY-like, mostra-se interessante. Portanto, com este projeto propomos caracterizar esta proteína quanto ao seu envolvimento na patogênese da leptospirose, expressão no curso da infecção e potencial imunogênico.
Objetivo Geral
GERAL: Expressar e caracterizar a proteína ErpY-like de L. interrogans em sua forma recombinante em imunoensaios e avaliar diferentes estratégias vacinais (subunidade, DNA, prime-boost e bacterina baseada em Escherichia coli) utilizando como adjuvantes: polissacarídeo xantana, Addavax, Alhydogel e flagelina de Salmonella, visando o controle da leptospirose.
ESPECÍFICOS:
• Clonar o gene erpY-like nos vetores de expressão pAE e pTARGET;
• Expressar e purificar a proteína recombinante ErpY-like, baseada no sistema procarioto E. coli;
• Determinar a funcionalidade da construção pTARGET/erpY-like através de teste de transfecção em células CHO e avaliar a expressão da proteína recombinante nestas células através de imunofluorescência e Western blot;
• Avaliar a reatividade da proteína recombinante com soro de humanos e animais com leptospirose adquirida de forma natural;
• Produzir anticorpos policlonais contra a proteína ErpY-like utilizando camundongos BALB/C e determinar os isotipos (IgM, IgG total, IgG1 e IgG2a), além disso, determinar o perfil de resposta imune celular induzido neste modelo animal, por meio de ensaios de proliferação de linfócitos e produção de citocinas (IL-4, IL-10, IFN-ɣ e TNF-α) no sobrenadante do cultivo de esplenócitos através de ELISA;
• Avaliar a presença do gene erpY-like, bem como, da proteína nativa em diferentes sorovares patogênicos e saprófitos de Leptospira, utilizando as técnicas de PCR e Western blot, respectivamente;
• Testar a habilidade da proteína recombinante ErpY-like em interagir com diferentes componentes da matriz extracelular (ECM);
• Determinar a inibição da ligação de Leptospira sp. viva aos componentes da ECM por ErpY-like recombinante;
• Imunizar hamsters com diferentes estratégias vacinais (subunidade, DNA, prime-boost e bacterina baseada em Escherichia coli) utilizando como adjuvantes: polissacarídeo xantana, Addavax, Alhydrogel e flagelina de Salmonella);
• Avaliar o potencial imunoprotetor e esterilizante das vacinas nos hamsters imunizados e desafiados com cepa virulenta de L. interrogans.
ESPECÍFICOS:
• Clonar o gene erpY-like nos vetores de expressão pAE e pTARGET;
• Expressar e purificar a proteína recombinante ErpY-like, baseada no sistema procarioto E. coli;
• Determinar a funcionalidade da construção pTARGET/erpY-like através de teste de transfecção em células CHO e avaliar a expressão da proteína recombinante nestas células através de imunofluorescência e Western blot;
• Avaliar a reatividade da proteína recombinante com soro de humanos e animais com leptospirose adquirida de forma natural;
• Produzir anticorpos policlonais contra a proteína ErpY-like utilizando camundongos BALB/C e determinar os isotipos (IgM, IgG total, IgG1 e IgG2a), além disso, determinar o perfil de resposta imune celular induzido neste modelo animal, por meio de ensaios de proliferação de linfócitos e produção de citocinas (IL-4, IL-10, IFN-ɣ e TNF-α) no sobrenadante do cultivo de esplenócitos através de ELISA;
• Avaliar a presença do gene erpY-like, bem como, da proteína nativa em diferentes sorovares patogênicos e saprófitos de Leptospira, utilizando as técnicas de PCR e Western blot, respectivamente;
• Testar a habilidade da proteína recombinante ErpY-like em interagir com diferentes componentes da matriz extracelular (ECM);
• Determinar a inibição da ligação de Leptospira sp. viva aos componentes da ECM por ErpY-like recombinante;
• Imunizar hamsters com diferentes estratégias vacinais (subunidade, DNA, prime-boost e bacterina baseada em Escherichia coli) utilizando como adjuvantes: polissacarídeo xantana, Addavax, Alhydrogel e flagelina de Salmonella);
• Avaliar o potencial imunoprotetor e esterilizante das vacinas nos hamsters imunizados e desafiados com cepa virulenta de L. interrogans.
Equipe do Projeto
| Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
|---|---|---|---|
| BEATRIZ BARROS RASIA | 12 | 01/08/2018 | 31/08/2018 |
| BEATRIZ BOHNS PRUSKI | 12 | 01/08/2016 | 31/07/2017 |
| BÁRBARA COUTO ROLOFF PADILHA | 1 | 16/12/2015 | 01/10/2019 |
| CHARLES KLAZER GOMES | 1 | 16/12/2015 | 01/10/2019 |
| GUILHERME ROIG PUREZA INDA | 1 | 16/12/2015 | 01/10/2019 |
| HENRIQUE QUEIROZ SIMÃO | 12 | 01/08/2016 | 31/07/2017 |
| MARTA GONCALVES AMARAL | 1 | 16/12/2015 | 01/10/2019 |
| MIRIAN ELERT DA SILVA | 12 | 01/09/2018 | 31/07/2019 |
| ODIR ANTONIO DELLAGOSTIN | 1 | 16/12/2015 | 01/10/2019 |
| RODRIGO ANDRADE SCHUCH | 1 | 16/12/2015 | 01/10/2019 |
| STELLA BUCHHORN DE FREITAS | 12 | 01/08/2018 | 28/02/2019 |
| STELLA BUCHHORN DE FREITAS | 12 | 01/08/2017 | 31/07/2018 |
| STELLA BUCHHORN DE FREITAS | 12 | 01/08/2016 | 31/07/2017 |
| THAIS LARRÉ OLIVEIRA BOHN | 1 | 16/12/2015 | 01/10/2019 |
| THAYNÁ LANER CARDOSO | 12 | 01/03/2019 | 31/07/2019 |