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A expectativa de vida dos humanos está aumentando (Christensen et al., 2009) e com ela a incidência de doenças crônicas (Fabbri et al., 2015). Além disto, as mulheres têm optado cada vez mais por terem filhos em idade mais avançada, nos EUA aproximadamente 40% dos nascimentos são de mulheres com mais de 30 anos de idade. Muitas vezes isso gera um problema de fertilidade devido a aproximação da menopausa e aumento de anormalidade cromossômicas e morte embrionária precoce (Treff et al., 2016). Folículos ovarianos são importantes componentes do ovário de um mamífero. Exaustão dos folículos resulta na menopausa e no final da vida reprodutiva feminina (te Velde et al., 1998). Estudos têm demonstrado que o envelhecimento fisiológico pode ser diminuído através de modulação de vias relacionadas à detecção de nutrientes (Salminen and Kaarniranta, 2012). A restrição calórica (RC) sem desnutrição é uma das intervenções que se demonstra capaz de aumentar a longevidade e diminuir a incidência de doenças relacionadas ao envelhecimento em mamíferos (Fontana and Partridge, 2015, Garcia et al., 2019). Além disso, a RC aumenta a duração do período fértil em camundongos, visto que a RC inibe a transição de folículos primordiais para folículos primários, resultando no adiamento do esgotamento folicular (Li et al., 2011). Nosso grupo demonstrou que os camundongos Ames dwarf, que são deficientes na secreção de GH (Bartke, 2005), também tem um envelhecimento ovariano reduzido e que isso é acompanhado pela redução da fosforilação da FoxO3a e um perfil de expressão gênica caracterizado pela redução de expressão de fatores de crescimento e inflamatórios (Schneider et al., 2017; Saccon et al., 2016). A RC dificilmente poderia ser aplicada em humanos, devido à dificuldade de controle da restrição e possíveis efeitos colaterais (Dirks and Leeuwenburgh, 2006). Nesse contexto, intervenções farmacológicas que atuem nestas vias associadas à detecção de alimentos podem ser alternativas eficazes na diminuição dos efeitos do envelhecimento. O 17αEstradiol (17αE2) é um enantiômero natural do 17ßEstradiol e apresenta-se como uma molécula capaz de aumentar a longevidade em camundongos machos (Stout et al., 2017). Apesar de ser encontrado em diversos tecidos (Toran-Allerand, 2005) suas funções endógenas ainda não foram totalmente elucidadas. Por ter baixa afinidade com os receptores estrogênicos clássicos, o 17αE2 não apresenta efeitos feminilizantes (Anstead et al., 1997). O 17αE2 está presente no cérebro, onde acredita-se que esteja envolvido na proteção dos neurônios (Ikeda et al., 2015). Ainda no cérebro, o 17αE2 promove a saciedade, atuando em vias anorexígenas e causando diminuição no consumo (Steyn et al., 2018). Esta diminuição no consumo alimentar de certa forma mimetiza a RC, daí seus efeitos similares com relação ao aumento da longevidade e outras alterações metabólicas (Stout et al., 2017). Dados preliminares do nosso grupo indicam efeitos do 17αE2 nos ovários de camundongos, enquanto estudos recentes vêm demonstrando diferenças nos efeitos do 17αE2 entre machos inteiros, machos castrados e fêmeas (Garratt et al., 2018), sugerindo relação do 17αE2 com as gônadas. Além disto, em machos, o tratamento com 17aE2 aumentou a abundância de vários aminoácidos no fígado, o que foi associado a elevações nos metabólitos envolvidos no ciclo da uréia, sugerindo alterações no metabolismo dos aminoácidos (Garratt et al., 2018). Neste contexto, se faz necessário um maior entendimento dos possíveis efeitos do 17αE2 tanto na reserva ovariana e fertilidade de fêmeas como na fertilidade de machos.

Animais e tratamentos
Serão utilizados 72 camundongos fêmeas da linhagem C57BL/6. Os animais serão mantidos sob condições controladas de luz e temperatura (22 ± 2 °C, ciclos 12 horas claro/12 horas escuro). Os camundongos fêmeas serão divididos em 4 grupos. Um grupo (controle) receberá ração normal ad libitum, outro (17αE2) receberá ração acrescida de 17αE2, um terceiro (RC30) receberá RC de 30%, enquanto um quarto grupo (RC10) receberá restrição alimentar de 10%. O tratamento será iniciado aos 3 meses de idade e terá duração de 6 meses. Aos após 6 meses de tratamento metade das fêmeas de cada grupo será alocada com machos para observar a taxa de prenhez, número de filhotes nascidos por ninhada e sobrevivência destes filhotes. As pertencentes aos grupos RC30 e RC10 receberão alimentação ad libitum por 10 dias prévios ao acasalamento. As fêmeas pertencentes à outra metade serão eutanasiadas para a coleta de tecido ovariano. Previamente à eutanásia estas últimas serão sincronizadas e acasaladas para produção de embriões que serão coletados no momento da eutanásia.
Além disto, serão utilizados 18 camundongos machos, que serão divididos em dois grupos: Controle e tratamento com 17α-E2 (acrescido à ração). Estes animais iniciarão o tratamento com 3 meses de idade e após 4 meses de tratamento serão acasalados na proporção 1:2 com fêmeas (n=32) previamente sincronizadas. Três dias após o acasalamento as fêmeas serão eutanasiadas para coleta dos embriões e os machos para coleta dos testículos para análise de qualidade seminal e expressão gênica.

Análises do tecido ovariano
Os ovários serão coletados e mantidos no formol tamponado 10%, depois desidratados em álcool, clareados em xilol e incluídos em paraplast. Os ovários incluídos em paraplast serão sequencialmente cortados a uma espessura de 5μm no micrótomo semi-automático Leica modelo RM2245 (Leica Biosystems Newcastle Ltd, Newcastle Upon Tyne, UK). Serão selecionados 1 a cada 6 cortes e colocados em lâminas histológicas padrão. Todo o ovário será cortado e utilizado. As lâminas, após secagem na estufa a 56°C por pelo menos 48 horas, serão coradas por hematoxilina-eosina e montadas com lamínulas e resina sintética (Sigma Chemical Company®, St. Louis, MO, EUA). As imagens dos cortes ovarianos serão capturadas por uma câmera digital Moticam 5.0 (Motic®, Hong Kong, China) acoplada a um microscópio Nikon Eclipse E200 (Nikon Corporation, Japan), utilizando objetivas de 4, 10 e 40X. Os folículos quantificados serão aqueles que apresentaram o núcleo dos oócitos claramente visível. A quantidade final de folículos será multiplicada duas vezes, mimetizando a quantidade de folículos dos dois ovários e multiplicada por seis para contabilizar a amostragem por seção. O protocolo que será utilizado é baseado em Myers et al. (2004).
Será classificado como folículo primordial aquele em que o oócito é rodeado por uma única camada de células da granulosa achatadas. O folículo em transição será classificado como aquele em que ao menos uma célula da granulosa em formato cuboide. O folículo primário será classificado como aquele em que um oócito rodeado por uma única camada de células da granulosa em formato cuboides. Um folículo será determinado como sendo um folículo secundário quando rodeado por mais do que uma camada de células da granulosa cuboides, sem antro visível, e um folículo será determinado como sendo um de folículos terciário se um espaço antral estiver claramente definido e preenchido por líquido folicular e uma camada de células da granulosa em torno do oócito (Myers et al., 2004).

Expressão gênica de ovários e testículos
A extração de RNA total do ovário ou testículo será realizada utilizando protocolo com reagente isotiocianato de guanidina (Trizol, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) associado a um kit de purificação por coluna (Quiagen, Hilden, Alemanha), conforme o protocolo do fabricante. Brevemente, será utilizado Trizol para homogeneizar o tecido usando um homogeneizador de tecidos. Após centrifugação a 12.000 x g por 10 minutos à 4°C, será coletado o sobrenadante descartando os restos celulares e eventual porção gordurosa. As amostras serão incubadas durante 5 minutos a temperatura ambiente a fim de completar a dissociação das nucleoproteínas complexas. Após adição de clorofórmio, o tubo será manualmente agitado por 15 segundos e incubado por 2 a 3 minutos à temperatura ambiente e depois centrifugado a 12.000 x g durante 10 minutos a 4°C. Neste procedimento serão separadas 3 fases. A fase aquosa contendo o RNA será removida e armazenada em um novo tubo livre de ribonucleases. Para a precipitação do RNA, será adicionado isopropanol 100% para cada amostra, as quais serão incubadas a temperatura ambiente durante 5 minutos e transferidos para a coluna. O RNA será então eluido em 20 µL de H2O livre de ribonucleases e sua concentração será aferida utilizando espectrofotômetro (NanoDrop Lite, Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA), em que a pureza das amostras será verificada através da taxa de absorbância 260/280 nm. Todas as amostras serão ajustadas para 200 ng/µL. As amostras obtidas serão armazenadas à -80ºC até sua utilização.
O DNA complementar (cDNA) será sintetizado a partir de 1 μg de RNA total utilizando kit comercial (iScript cDNA Synthesis Kit, Biorad, Hercules, CA, USA), seguindo as recomendações do fabricante. A PCR em tempo real (RTq-PCR) será conduzida usando GoTaq® qPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, USA) no equipamento StepOne 7500 RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Para cada ensaio serão corridos 45 ciclos (95°C durante 15s e 60 °C durante 60s) e uma curva de dissociação será incluída no final da reação para verificar a amplificação de um único produto de PCR. Os genes β-2-microglobulina (β2m) e β Actina (βAct) serão utilizados como controles endógenos.
Serão analisados os genes relacionados à reserva ovariana: fator de diferenciação de crescimento 9 (Gdf9), hormônio anti-mulleriano (Amh), proteína morfogenética óssea 15 (Bmp-15), genes relacionados à ativação de folículos primordiais: proteína quinase B (Akt1), fosfoinositídeo-3-quinase (Pi3k), Fator de Transcrição Forkhead Box da classe O3a (Foxo3a), receptor tirosina quinase Kit de células da granulosa e Kit Ligand (Kitl).
A expressão relativa será calculada a partir da equação 2A-B/ 2C-D (em que A é o valor limiar do ciclo [Ct] para o gene de interesse na primeira amostra do controle; B, o valor de Ct para o gene de interesse na amostra analisada; C, a média geométrica dos valores de Ct para os genes β2m e βact na primeira amostra do controle e D, a média do Ct para os genes β2m e βact na amostra analisada). A primeira amostra do controle será expressa como 1,00 por esta equação, e todas as outras amostras serão calculadas em relação a este valor. Depois disso, os resultados do grupo controle serão ponderados, e todos os outros resultados serão divididos pelo valor médio da expressão relativa no grupo controle, para se obter a mudança na expressão dos genes de interesse em comparação com o grupo controle (Fold change) (Masternak et al., 2005).

Sincronização de estro e análise dos embriões
Para sincronização da ovulação dos animais será feita aplicação intraperitoneal de 5 UI de eCG 5 dias prévios à eutanásia e 5 UI de hCG seguido por acasalamento 3 dias prévios à eutanásia. Após a eutanásia será realizada a lavagem dos ovidutos dos animais para recuperação dos embriões. Será então obtido o número de total de estruturas recuperadas e o número de estruturas viáveis. Após, os embriões serão fixados em lâminas histológicas e corados com HOESCHT, que cora os núcleos celulares, possibilitando a contagem do número de células presentes nos embriões.

Análises seminais
Epidídimos e ductos deferentes serão extraídos dos camundongos após a eutanásia. Em uma placa de petri estas estruturas serão lavadas e maceradas para extração dos espermatozoides.
Serão analisados os parâmetros espermáticos: mobilidade total e progressiva e morfologia, utilizando o equipamento CASA. Bem como porcentagem de espermatozoides viáveis e não viáveis e status acrossomal através da fixação em lâminas histológicas e técnicas de imunofluorescência.

Este trabalho poderá trazer novos dados sobre possíveis efeitos do tratamento com 17αE2 na manutenção da reserva ovariana e fertilidade de camundongos, em função de demonstrar ou descartar a possibilidade de que tal substância cause malefícios ou benefícios na reprodução dos indivíduos tratados.
Este projeto se associa com nossa linha de pesquisa, que visa analisar modelos de aumento à longevidade e seus possíveis efeitos na fertilidade e longevidade reprodutiva de mamíferos. Acreditamos que esta linha de estudo tem bastante potencial, pois poucos trabalhos são produzidos tendo como enfoque a saúde e fertilidade de machos e fêmeas frente ao envelhecimento e a tentativas de prolongar a longevidade. Esta temática vem ganhando destaque visto que a expectativa de vida da população vem aumentando nos últimos anos e com isso a incidência de diversos tipos de enfermidades ligadas a idade como câncer, diabetes e doenças cardiovasculares. Estes aspectos têm sido explorados em pesquisas clínica com seres humanos de maneira inicial pelo nosso grupo também, por isso torna-se importante a confirmação de hipóteses em camundongos e in vitro para guiar os estudos com seres humanos. Além disso, grupos de pesquisa no exterior já estão iniciando procedimentos para teste clínicos em larga escala em seres humanos com o 17αE2. Desta maneira precisamos entender melhor o efeito deste hormônio sobre a fertilidade.