Nome do Projeto
O emprego de mutantes fotossintéticos de Arabidopsis thaliana para o estudo e compreensão dos mecanismos de eficiência de conversão da luz em energia química e dissipação térmica da luz em estresse abiótico - etapa II
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/06/2020 - 31/05/2024
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
A fotossíntese aeróbica é o processo de conversão de luz em energia em nossa biosfera, transforma a energia dos fótons na energia de carboidratos. Na fotossíntese de organismos eucarióticos, reações luz-dependentes são realizadas por dois complexos supramoleculares (fotossistemas), que catalisam a absorção da luz e transporte de elétrons da água para o NADP+. Em ambientes naturais, as plantas são frequentemente expostas a flutuações rápidas na intensidade da luz, e quando o fornecimento de energia da luz está em excesso, outras funções do sistema de absorção da luz e do transporte de elétrons permitem a dissipação do excesso de energia absorvida livre. A operação integrada da fotossíntese, a dissipação de energia, e o equilíbrio entre a síntese de ATP e poder redutor está no centro da regulação fotossintética e suas respostas ao meio ambiente. Em alta luz, quando a quantidade de energia captada pelo LHC excede a capacidade de transporte de elétrons, outros mecanismos de-excitação tornam-se importantes. Este dano foto-oxidativo diminui a eficiência da fotossíntese, sendo denominado fotoinibição, assim a compreensão de detalhes moleculares de dissipação térmica abre a possibilidade de manipular a eficiência na utilização da luz, a fim de aumentar a produtividade das culturas. As informações de como as plantas respondem a luz alta e como elas desenvolvem mecanismos de regulação nos ajuda a entender os limites da eficiência do uso da radiação e sua tolerância ao ambiente estressante. O uso de mutantes como ferramentas experimentais na análise dos fenômenos fotossintéticos é uma abordagem bem estabelecida, e grandes coleções de mutantes estão disponíveis em espécies em diversos organismos experimentais. A caracterização e uso de um grupo de mutantes de Arabidopsis thaliana contribui para o conhecimento e análise do processo fotossintético. Os mutantes com alterações na fotossíntese têm sido amplamente adotados como ferramentas experimentais e têm sido muito úteis em muitos aspectos de pesquisas. Respostas dos mutantes para alta irradiação podem oferecer informações importantes sobre os estudos das relações funcionais dentro dos processos de fotossíntese e servem potencialmente para a construção de novos genótipos com maior tolerância ao stress ambiental, e é possível identificar processos importantes envolvidos na fotoproteção ao estresse. Estudos futuros envolvido no controle da fotossíntese nos permitirá manipular a produtividade da planta e sua capacidade em crescer em diferentes ambientes, frequentemente adversos. Este projeto tem como objetivo analisar os mecanismos envolvidos no uso de energia luminosa e dissipação térmica de energia absorvida em plantas superiores (A. thaliana) em condições de estresses abióticos, com ênfase em fotoproteção. O projeto será o desenvolvimento com uso de mutantes de A. thaliana, fornecidos em cooperação pelo Prof. Dr. Roberto Bassi responsável pelo Laboratorio di Fotosintesi, Departamento de Biotecnologia da Università degli Studi di Verona.

Objetivo Geral

Este projeto tem por objetivo continuar a analisar os mecanismos envolvidos no aproveitamento da energia luminosa absorvida pelos fotossistemas das plantas superiores usando Arabidopsis thaliana como modelo biológico, com ênfase na fotoproteção e compreensão dos mecanismos de dissipação da energia de excitação nos fotossistemas e na cadeia de transporte de elétrons da fotossíntese.

Justificativa

Fotossíntese aeróbica é o processo mais comum de conversão de luz em energia em nossa biosfera, transforma a energia de fótons em energia de hidratos de carbono, pela redução do carbono do CO2 utilizando elétrons extraídos da água. Embora pareça ser uma reação química simples, organismos fotossintéticos evoluíram uma cascata extremamente complexa de eventos de transformação de energia que realmente fazer essa reação possível.
A absorção da luz solar pela fotossíntese em organismos oxigênicos é feito por pigmentos ligados aos complexos proteína-pigmento coletores de luz associados com os centros de reação do aparato fotossintético. Na fotossíntese eucariótica, as reações dependentes de luz são feitos por dois complexos supramoleculares, chamado fotossistemas I e II (PSI e FSII), que catalisam a absorção de luz e de transporte de elétrons a partir de água para NADP+.
Cada fotossistemas tem duas partes: (i) centro de reação (RC) e (ii) o sistema de antena periférico ou complexo coletor de luz (LHC - LHCII para PSII e LHCI para PSI). Os centros de reação são responsáveis pela separação de carga e pelos primeiros passos do transporte de elétrons. O sistema de antena, subunidades polipeptídicas ligadas a clorofilas (Chs), e xantofilas, está localizado perifericamente no fotossistemas, e é responsável pela absorção de luz e transferência de energia de excitação para os centros de reação, e reações de fotoproteção aos estados excitados tripleto e singleto.
Quando o fornecimento de energia da luz está em excesso, outra função destes sistemas permite a dissipação do excesso de energia absorvida livre. A operação integrada da fotossíntese, da dissipação de energia, e do equilíbrio entre a síntese de ATP e redutor está no centro da regulação fotossintética e suas respostas ao meio.
O transporte de elétrons na fotossíntese incorpora caminhos lineares e cíclicos e o transporte de prótons acoplado a este transporte de elétrons resulta na formação de um potencial transtilacoidal de prótons (H+). Esta força motriz de prótons é importante por dois motivos: a) conduz à formação de ATP, através da ATPase; e b) torna o lúmen do tilacóide mais ácido, que controla oxidação da plastoquinol pelo complexo citocromo b6/f.
Em ambientes naturais de crescimento, as plantas são frequentemente expostas a flutuações rápidas na intensidade da luz. Sob condições normais de luz, o aparelho fotossintético é muito eficiente na captação de energia da luz de excitação e a transferência de energia para o RC. Em alta luminosidade, quando a quantidade de energia captada pelo LHC excede a capacidade de transporte de elétrons, outros mecanismos de-excitação tornam-se importante. Nesta condição a fotossíntese gera intermediários altamente reativos, e pode causar danos oxidativos ao aparato fotossintético, que diminui a eficiência e/ou a taxa máxima de fotossíntese, denominado fotoinibição que pode afetar a fotossíntese do dossel em até 30%. Assim a compreensão dos detalhes moleculares de dissipação térmica abre a possibilidade de manipular a eficiência na utilização da luz, a fim de melhorar a produtividade das culturas.
As informações de como as plantas respondem a alta luz e como elas envolvem mecanismos de regulação ajudam a entender os limites da eficiência do uso da radiação e sua tolerância ao ambiente estressante, sendo que a aclimatação à luz requer plasticidade regulatória da maquinaria.
Com o incremento da luminosidade, a taxa de fotossíntese pode se saturar, e o excesso de energia que é absorvida pode formar espécies de oxigénio reativas prejudiciais. Desta forma, as plantas desenvolveram vários mecanismos, denominados "“nonphotochemical quenching”" (NPQ), para dissipar o excesso de energia absorvida, e a quantidade de dissipação de energia pode ser monitorizado pela extinção não-fotoquímica de fluorescência da clorofila.
NPQ é constituído por diferentes componentes, denominados "qE", "qZ," "qT," e "qI", sendo separados com base nas suas cinéticas de indução e de relaxação: a) qE - um componente rapidamente reversível, resultando na dissipação térmica do excesso de energia absorvida em luz na antena do PSII; induzido por um baixo pH do lúmen do tilacóide e um elevado gradiente de pH através das membranas tilacóides (pH), quando o pH é baixo no lúmen tilacóides há a protonação da subunidade proteína S do PSII (PsbS), e ativa a violaxantina de-epoxidase (VDE), que converte a violaxantina em zeaxantina; b) qZ – extinção dependente da zeaxantina – ligado e desligado em dezenas de minutos; requer a formação de zeaxantina (Brooks et al., 2013), mas é independente do pH do lúmen, uma vez que a zeaxantina está presente, sendo que provavelmente envolva a pequena proteína de ligação de clorofila do sistema antena (CP-26); c) qT – estado de transição, mostra cinética semelhante à qZ, mas funciona para equilibrar a absorção de luz entre PSI e PSII, requerendo uma quinase (STN7); d) qI - extinção fotoinibitório depende mais de um mecanismo, requer ca. 1 h.
Dissipação do excesso de energia associada com qE é considerado o processo de regulação principal para fotoproteção de PSII porque é ativado pela geração induzida pela luz de um gradiente de pH através das membranas tilacóides (pH), assim pH atua como um sinal de realimentação indicando o grau de saturação do transporte fotossintético de elétrons.
Tem sido proposto o papel da proteína PsBs nos diferentes mecanismos NPQ. É sugerido que a proteína PsBs é o local de extinção onde o calor é dissipado do PSII, contudo resultados contraditórios relativos à capacidade de PsBs de vincular xantofila, ou seja, zeaxantina, e as moléculas de Chl. Autores propuseram seu efeito no desenvolvimento do NPQ e na regulação da estrutura semi-cristalina, desta forma assim a PsBs desempenha papéis importantes na remodelação do supercomplexo PSII-LHCII, e na coordenação da transferência de alta energia e dissipação excessiva de energia em membrana tilacóides. Outros autores sugerem que a proteína PsBs tem uma função como um sensor de pH do lúmen através dos resíduos protonáveis expostas ao lúmen. No entanto, em face de estudos seu papel exato permanece um.
Também é relatado que qE depende da existência de moléculas de xantofila ligados às proteínas da antena do PSII. Os autores mostraram que a conversão da violaxantina a zeaxantina (ciclo-violaxantina anteroxantina-zeaxantina), em conjunto com a formação de um pH, leva ao incremento de qE durante a iluminação com altas intensidades de luz.
O ciclo xantofila compreende de uma reação direta em que o violaxantina (xantofila di-epóxi) é de-epoxidada à zeaxantina (xantofila livre de epóxi). O intermediário desta sequência é a anteroxantina (contém um grupo epoxi). O aumento desta reação sob alta intensidade luminosa é catalisada pela enzima de violaxantina-epoxidase (VDE). A reação inversa do ciclo xantofila (por uma re-introdução gradual dos dois grupos epóxi), é normalmente observada durante períodos de baixa iluminação ou no escuro, e é catalisada pela enzima zeaxantina epoxidase (ZE).
A primeira evidência para a participação do ciclo xantofila no NPQ surgiu durante a década de 1980. Estes autores observaram uma relação entre a cinética de síntese e zeaxantina a dissipação térmica de energia de excitação, medida como NPQ, em várias espécies. Estes resultados foram confirmados pelo uso da ditiotreitol (VDE inibidor), o que causou uma grande diminuição de NPQ, confirmando a importância de zeaxantina para o mecanismo de aumento da dissipação de calor de energia de excitação, para assumir a energia de excitação a partir de um singleto Chl a exitada.
A descoberta de que a acumulação de zeaxantina correlaciona a com a extensão do NPQ in vivo permitiu a sugestão de um mecanismo do envolvimento de qE: VDE é ativada por baixo pH no lúmen que ocorrem em excesso de luz, e a zeaxantina formada é um “extintor” (quencher) da clorofila no estado excitado. Vários resultados mostraram que o NPQ ligado a zeaxantina pode ser produzido se o lado luminal da membrana de tilacóides apresenta uma elevada concentração de prótons, ou seja, um pH baixo (Quaas et al 2015). No entanto, a natureza exata do site de extinção dentro da antena PSII ainda é uma questão de debate e diferentes modelos estruturais para qE têm sido propostos.
O uso de mutantes como ferramentas experimentais na análise da fotossíntese é uma abordagem bem estabelecida, e grandes coleções de mutantes estão disponíveis em muitas espécies. Um grande número de estudos que utilizam mutantes é descrito na literatura como: PSI mutantes deficientes, mutantes com deficiência de PSII, mutantes com deficiência de clorofila, os mutantes deficientes em carotenoides, NPQ -deficiente, e outros. A caracterização e utilização de um grupo de mutantes de Arabidopsis thaliana, microalga verde (principalmente Chlamydomonas reinhardtii) e musgos (principalmente Physcomitrella patens) contribuiu para o conhecimento do processo fotossintético. Mutantes com alterações na fotossíntese têm sido amplamente adotado como ferramentas experimentais e tem sido muito útil em muitos aspectos da investigação.
A resposta dos mutantes (algas, musgos e plantas mutantes) a alta irradiação pode oferecer informações importantes sobre as relações funcionais dentro dos processos fotossintéticos e servem potencialmente para a construção de novos genótipos com maior tolerância ao stress ambiental máquinas. Bem como é possível identificar importantes processos envolvidos na fotoproteção e respostas ao estresse. Um conjunto diversificado de técnicas, incluindo a genética, fisiologia, bioquímica, biologia molecular, espectroscopia, e da genômica, são utilizados para caracterizar os mutantes e para avaliar a significância fisiológica de diferentes mecanismos de proteção.

Metodologia

Os mutantes de Arabidopsis thaliana que serão utilizados nos experimentos serão fornecidos pelo grupo de pesquisa do Dr. Roberto Bassi do "Laboratorio di Fotosintesi" da Università degli Studi di Verona. Os genótipos a serem utilizados serão os descritos com diferentes características fotossintéticas: WT, Lut2, npq4,
a) Métodos
1. Cultivo e crescimento das plantas: Sementes de diferentes genótipos de A. thaliana serão colocadas em pequenos potes para escarificação por 48 h a 4°C no escuro. A seguir serão transferidas para câmara de crescimento por período de 4 a 5 semanas para câmaras de crescimento (22°C dia/18°C noite e 60% unidade relativa) com fotoperíodo de 16 h a 100 μE m-2 s-1 e 8 h de escuro.
2. Avaliação da cinética de emissão da fluorescência transiente ou polifásica (O-J-I-P): A emissão da fluorescência transiente da clorofila a será medida em folhas jovens totalmente expandidas, utilizando-se um fluorômetro portátil (Instrument Hansatech Ltd., Lynn King, Norfolk, PE30 4NE, UK). As medidas serão realizadas no período da manhã em folhas previamente adaptadas ao escuro, por um período suficiente para a oxidação completa do sistema fotossintético de transporte de elétrons. As variáveis biofísicas que quantificam o fluxo de energia através do FSII serão analisadas segundo o teste JIP proposto por Strasser e Strasser (1995).
3. Avaliação simultâneas de cinética de emissão de fluorescência (PF), decaída da fluorescência e reflexão modulada em 820 nm (atividade do fotossistema I): A cinética de emissão de fluorescência da clorofila (PF), decaída da fluorescência (DF) e reflexão modulada em 820 nm (MR) serão registradas simultaneamente com a Multifunctional Plant Efficiency Analyser M-PEA-2 (Instrument Hansatech Ltd., Lynn King, Norfolk, PE30 4NE, UK). As folhas serão adaptadas ao escuro durante 30 min, a seguir serão iluminadas com intensidade de luz actínica de 5.000 µmol fótons m-2 s-1 por 60 segundos. A PF, DF e MR serão registros durante a iluminação e medidos conforme descrito por STRASSER et al. 2010.
4. Cinética de indução e relaxamento da emissão de fluorescência – análise de NPQ: Os parâmetros da fluorescência modulado in situ das clorofilas serão medidos usando um fluorômetro de imagem (IMAGEM-MAX) (Heinz Walz Gmbh, Effeltrich, Alemanha). Para a determinação da fluorescência rápida, as folhas destacadas acondicionadas em placas com papel umedecido, serão adaptadas ao escuro durante 15 minutos, quando, então, receberão um fluxo de radiação igual a 0,12 µmol m-2s-1 para a determinação da fluorescência inicial (F0). A fluorescência máxima (FM) será determinada após um pulso de fótons saturante de 4.000 µmol m-2 s-1. A fluorescência variável (FV) será calculada pela equação FV = FM – F0 e a eficiência fotoquímica máxima do fotossistema II serão expressa pela razão FV/ FM. A seguir será ligada um da luz actínica de aproximadamente 800 µmol m-2s-1 (intensidade a ser definida em ensaios preliminares) por um período de 30 minutos e em intervalos de um minuto será aplicado um pulso saturante de 4.000 µmol m-2s-1, obtendo-se FM' (fluorescência máxima em estado adaptado a luz), decorrido o período de 30 minutos a luz actínica será desligada e novamente pulsos saturante em intervalos de 2 minutos serão aplicados, o período total de escuro será de 15 minutos. Imediatamente antes de cada pulso saturante será medida a fluorescência em estado de equilíbrio (Fs) e a fluorescência inicial (F0’). A partir destes parâmetros será possível o cálculo: coeficientes de extinção fotoquímico (qP) e não-fotoquímico (qN) como qP = (FM’ – Fs)/( FM’ – F0’) e qN = (FM – FM’)/( FM – F0), respectivamente; NPQ = (FM /FM’) – 1, extinção não fotoquímica; eficiência quântica fotoquímica efetiva em estado adaptado a luz (FV’/ FM’); produção quântica efetiva do FS II (ΦPS2 = (FM' – FS)/ FM' ) (GENTY et al. 1989); taxa de transporte de elétrons no fotossistema II (ETR = ΦPS2 x PFD x 0,5 x 0,85).
5. Análise do coeficiente de extinção (quenching) dependente de energia (qE) e coeficiente de extinção (quenching) fotoinibitório (qI): O quenching dependente de energia será determinado após a folhas permanecerem por 15 minutos no escuro, aplicação pulso saturante e determinação da fluorescência inicial (F0) e fluorescência máxima (FM). A seguir será ligada um da luz actínica de aproximadamente 800 e 1200 µmol m-2s-1 por um período de 30 minutos, ao final deste período será aplicado um pulso saturante de 4.000 µmol m-2s-1, obtendo-se FM' (fluorescência máxima em estado adaptado a luz – FM’). Posteriormente, as folhas serão mantidas no escuro por 15 minutos e em intervalos de 5 minutos pulsos saturante serão aplicados, determinando-se FM” (fluorescência máxima em estado adaptado ao escuro após período de alta luminosidade). A partir dos parâmetros de FM, FM’ e FM’’, serão calculados os coeficiente de extinção (quenching) dependente de energia (qE) e coeficiente de extinção (quenching) fotoinibitório (qI) utilizando-se as fórmulas: qE = (FM/ FM’) – (FM/ FM’’) e qI = (FM - FM’’ / FM’)
6. Curva de saturação de luz em folhas não destacadas utilizando o Dual-PAM-100 e medida de P700: Medidas não invasivas de fluorescência modulada da clorofila serão realizadas usando o DUAL-PAM 100 Chlorophyll Fluorometer (Heinz Walz Gmbh, Effeltrich, Alemanha). Inicialmente as folhas serão adaptadas ao escuro por 30 minutos para obtenção dos valores de F0 e FM, a seguir a intensidade de luz actínica será alterada de forma a obtenção da curva de resposta à luz dos parâmetros de fluorescência. As intensidades e o tempo de manutenção da luz actínica serão definidas em ensaios preliminares. Serão calculados os parâmetros relacionados aos coeficientes de extinção fotoquímico e a taxa de transporte de elétrons II (ETR).
7. Trocas gasosas e curva de resposta da fotossíntese líquida (A) em função da fração molar intracelular de CO2 (Ci) e da densidade de fluxo de fótons (Q)
As características de trocas gasosas serão medidas em um sistema aberto por infravermelho (IRGA - LI-6400XT, Li-Cor Inc., NE, USA). Os parâmetros concentração intracelular de CO2 (Ci), condutância da folha ao vapor d’água (g), taxa de troca de CO2 (fotossíntese líquida – A) e taxa de transpiração (E) serão calculados segundo o modelo de Von Caemmerer e Farquhar (1981). Para determinação da curva A/Ci será realizada com o fornecimento gradual de CO2 em concentração conhecida (Ca) (previamente estabelecida em ensaios preliminares) por sistema de injeção apropriado e medida da fotossíntese líquida correspondente. Obtida a curva de resposta será utilizado o modelo proposto por Farquhar et al., (1980) que permite a estimativa: da atividade aparente da Rubisco (VCi max), da máxima taxa de transporte de elétrons usados na regeneração da ribulose 1,5-bisfosfato (Jmax) e da utilização da triose-fosfato (VTPU). A curva A/Ci será realizada em três diferentes densidades de fluxo de fótons.


Indicadores, Metas e Resultados

Dessa forma, ao final da execução das etapas propostas neste projeto, espera-se:

Avaliar parâmetros qualitativos e quantitativos de fluorescência das clorofilas e trocas gasosas de genótipos de Arabidopsis com características fotossintéticas diferencial;

Traçar um paralelo entre os diferentes genótipos de Arabidopsis, caracterizando sua performance de absorção de energia luminosa;

Avaliar o impacto de estresses abióticos nas plantas dos diferentes genótipos de Arabidopsis;

Compreensão dos aspectos biofísicos do fluxo de energia na cadeia de transporte de elétrons da fotossíntese para potencializar o aproveitamento da energia luminosa;

Desenvolver conhecimento científico básico sobre a relação entre a fluorescência das clorofilas, permitindo a consolidação da linha de pesquisa utilizando a fluorescência como instrumento de pesquisas em fisiologia vegetal;

Formação de recursos humanos em nível de iniciação científica e pós-graduação.

Publicação de artigos científicos e apresentação de trabalhos em eventos relacionados à área de fisiologia vegetal.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
CAROLINE HERNKE THIEL
FERNANDO HENRIQUE UEHARA
MARCOS ANTONIO BACCARIN5

Fontes Financiadoras

Sigla / NomeValorAdministrador
CAPES / Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível SuperiorR$ 437,50Coordenador
CAPES / Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível SuperiorR$ 450,00Coordenador
CAPES / Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível SuperiorR$ 450,00Coordenador

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