Portal InstitucionalUFPEL

Araucaria angustifolia (Bert.) O. Kuntze é uma conífera distribuída no Hemisfério Sul. Os frutos dessa conífera são conhecidos como pinha e suas sementes como pinhões. As sementes são constituídas por envoltório, polpa e embrião, frações ricas em celulose, amido e lipídeos, respectivamente (Conforti & Lupano, 2007; Rogge-Renner et al., 2013).
A casca do pinhão, rica em compostos fenólicos, é considerada um resíduo agroindustrial não explorado, que representa em torno de 20% do peso total do pinhão, sendo normalmente descartada no meio ambiente (Henríquez et al., 2008; Lima et al., 2007). Os compostos fenólicos apresentam atividade antioxidante e atividade antimicrobiana, podendo ser utilizados em diversos segmentos na indústria de alimentos (Sant’Anna et al., 2016; Trojaike et al., 2019). Entretanto, esses compostos mostram baixa estabilidade frente a diversos fatores, como luz, temperatura e oxigênio, sendo facilmente degradados, apresentando, com isso, uma aplicação restrita (Krichene et al., 2015)
Para preservar a integridade estrutural, os compostos fenólicos podem ser encapsulados em materiais que apresentem capacidade de protegê-los e entrega-los em locais desejados de forma controlada e/ou específica, sem perder sua bioatividade (Fang & Bhandari, 2010). Dentre diversas técnicas de encapsulação, o electrospinning se destaca na encapsulação de bioativos, por ser uma técnica de processamento simples, com alta eficiência e de baixo custo, além de não envolver altas temperaturas ou pressões ao produzir materiais em escala nanométrica, como fibras (Daudt et al., 2014; García-Tejeda et al., 2013; Moomand & Lim, 2014).
A eficácia da encapsulação por electrospinning está intimamente ligada à escolha do material de parede, em vista disso, diferentes polissacarídeos podem ser utilizados para esse fim, como o amido (Biduski et al., 2019; Fonseca et al., 2020; Fonseca et al., 2019; Lancuški et al., 2017; Xu et al., 2009). Este vem mostrando-se promissor para este fim, em razão do seu baixo custo e abundância (Daudt et al., 2014) e de sua biocompatibilidade e biodegradabilidade. Entretanto, ainda são escassos os estudos que utilizem amido como material de parede na produção de fibras para encapsulação de compostos.

Metodologia para a prorrogação do projeto
Material
O pinhão, Araucaria angustifolia (Bert.) O. Kuntze será adquirido de um produtor em Vacaria (Latitude: 28° 30' 39'' Sul, Longitude: 50° 55' 47'' Oeste), Rio Grande do Sul, Brasil. Para a produção das fibras ultrafinas de amido será utilizado amido solúvel de batata (C6H10O5, Sigma-Aldrich, CAS 9005-25-8) com teor de amilose de 32,5 ± 3,6% e ácido fórmico (85% de pureza, Synth, CAS 01A1034.01) como solvente.

Produção das fibras ultrafinas pela técnica de electrospinning
As soluções poliméricas formadoras de fibras serão preparadas com 5 g de amido de batata solúvel (50% p/v) em 10 mL de ácido fórmico 75% (88 mL de ácido fórmico em 12 mL de água ultrapura, v/v). A solução será agitada por 24 h para dissolução total e para atingir a gelatinização do amido e após ficará em descanso por 24 h. O extrato da casca de pinhão (ECP) será incorporado à solução nas concentrações de 0,5%, 1,0% e 1,5% (p/p) em base seca, e agitado por 30 min para completa homogeneização.
Para produção das fibras ultrafinas de amido e ECP pela técnica de electrospinning. As soluções serão colocadas em uma seringa plástica de 3 mL com agulha de aço inoxidável de 0,8 mm de diâmetro e bombeadas a uma taxa de fluxo constante de 0,60 mL.h-1 por uma bomba de infusão de seringa (KD Scientific, Model 100, Holliston, Inglaterra). Uma placa coletora de aço inoxidável aterrada será posicionada a 20 cm da ponta da agulha. Uma fonte de alimentação (INSTOR, INSES-HV30, Brasil) será utilizada para aplicar uma tensão de 25 kV no sistema. As fibras ultrafinas serão produzidas à temperatura ambiente (25 ± 2 ºC) e a umidade relativa ajustada em 45 ± 2% com um desumidificador.

Temperatura de fusão e entalpia
A temperatura de fusão e entalpia do ECP livre e das fibras ultrafinas de amido/ECP serão determinadas utilizando-se um Calorímetro Diferencial de Varredura (DSC-60, Shimadzu, Quioto, Japão). As amostras serão pesadas (aproximadamente 3 mg) em panelas de alumínio e aquecidas entre 0 a 300 °C, a uma taxa de 10 °C.min-1. As fibras sem o ECP serão utilizadas como controle. As propriedades determinadas serão: temperatura inicial de fusão (Ti), temperatura de pico (Tpico), temperatura final de fusão (Tf) e a entalpia de fusão (ΔHm).

Cristalinidade Relativa
Utilizando os valores de entalpia de fusão obtidos por DSC, será possível calcular a cristalinidade relativa (RC) das amostras.

Estabilidade térmica
A estabilidade térmica será realizada de acordo com Evangelho et al. (2019). As amostras do ECP e das fibras ultrafinas de amido/ECP (10 mg) serão armazenadas em frascos de vidro e submetidas ao aquecimento em estufa sendo realizados dois tratamentos nas temperaturas de 100 e 180 °C, por 20 min. Um controle, no qual a amostra não foi submetida aos tratamentos será utilizado.
A estabilidade térmica será determinada através da quantificação dos compostos fenólicos totais do ECP e das fibras ultrafinas, pelo método de Swain & Hillis (1959), com modificações. Após os tratamentos com altas temperaturas, o ECP será dissolvido em 10 mL água ultrapura e as fibras ultrafinas dissolvidas em 1,5 mL de água ultrapura. Serão retiradas alíquotas de 30 µL da solução, homogeneizadas com 1200 µL de água ultrapura e 15 µL do reagente Folin-Ciocalteu 0,25 mol.L-1, e após 3 min, será adicionado 30 µL carbonato de sódio saturado 1 mol.L-1. Após 2 h de reação no escuro, a absorbância será medida por espectrofotômetro (SpectraMax 190, leitor de microplacas, Molecular Devices, EUA), a 725 nm. A quantificação será realizada utilizando a curva de calibração preparada com o ácido gálico, nas concentrações de 25 a 450 mg.mL-1. O conteúdo de compostos fenólicos será expresso em equivalentes de ácido gálico (mg EAG.g-1).

Atividade antioxidante
A atividade antioxidante in vitro do ECP e das fibras ultrafinas de amido/ECP será avaliada pela capacidade de eliminar o radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH) segundo o método descrito por Brand-Williams et al. (1995). A solução estoque de DPPH será preparada com 24 mg de DPPH em 100 mL de metanol, após uma alíquota de 10 mL dessa solução será diluída em 45 mL de metanol e a absorbância será ajustada para 1,10 a 515 nm. As amostras do ECP e das fibras serão pesadas (10 mg) e adicionadas a 3,9 mL do radical DPPH, agitadas em vórtex por 3 s e mantidas no escuro por 2 h 30 min de reação. A absorbância seraá medida a 515 nm utilizando um espectrofotômetro (SpectraMax 190, leitor de microplacas, Molecular Devices, EUA). Os resultados serão expressos em porcentagem de inibição do radical DPPH, sendo calculados em base seca.

Atividade antimicrobiana
Reativação dos microrganismos
Para a determinação da atividade antimicrobiana in vitro do ECP e das fibras ultrafinas serão utilizadas cepas padrão das espécies de bactérias Escherichia coli O157:H7 (ATCC 43895) e Staphylococcus aureus (ATCC 10832). A reativação destes microrganismos será realizada de acordo com a metodologia utilizada por Radünz et al. (2019), em que, primeiramente, uma alçada de cada bactéria será transferida para tubos contendo caldo Soja Tripticaseína (TSB) e incubadas em estufa durante 24 h a 37 °C. Em seguida, uma alçada desse crescimento será estriada em placas de Petri contendo os meios seletivos, sendo ágar Eosina Azul de Metileno (EMB) para E. coli e ágar Baird-Parker para S. aureus, e incubadas por 24 h a 37 °C, para o isolamento das colônias. Do crescimento bacteriano nas placas de Petri, será extraída uma alçada e ressuspendida em solução salina (NaCl 0,85%), que será padronizada na concentração 0,5 na escala de McFarland (1,5 x 108 UFC mL-1). Todos os ensaios serão realizados em triplicata.

Disco difusão
A análise de disco difusão será realizada seguindo a metodologia Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2015). Para isto, será semeada em placas de ágar Muller-Hinton uma alçada da solução salina padronizada contendo o inóculo. Em seguida serão adicionados discos de papel filtro esterilizados com diâmetro de 6 mm e sob os discos serão pipetados 5 µL de ECP. Após serão incubadas por 24 h a 37 °C e então será efetuada a medição dos halos de inibição com auxílio de um paquímetro, sendo os resultados expressos em milímetros das zonas de inibição.

Concentração inibitória mínima (CIM)
A CIM será realizada de acordo com o método descrito por Cabral et al. (2009), com modificações. Para isto serão utilizadas placas de microtitulação de 96 poços, em que serão acrescentados em cada poço 180 µL de caldo de infusão cérebro-coração (BHI), e 20 µL de água salina (concentração) com crescimento bacteriano (inóculo) e ECP em cinco diferentes concentrações (100, 20, 10, 1 e 0.1 mg.mL-1) e três concentrações de cada uma das fibras ultrafinas de amido/ECP (100, 20 e 10 mg.mL-1). As placas serão lidas em espectrofotômetro de placas (SpectraMax 190, leitor de microplacas, Molecular Devices, EUA) a 620 nm. Em seguida, proceder-se-á a incubação por 24 h a 37 °C, e após, será realizada uma nova leitura em espectrofotômetro (SpectraMax 190, leitor de microplacas, Molecular Devices, EUA). A CIM será considerada como a menor concentração em que não houve crescimento bacteriano no meio de cultura.

Concentração bactericida mínima (CBM)
A CBM será realizada de acordo com o método descrito por Cabral et al. (2009) com pequenas modificações. Após a realização da CIM, serão retirados 15 µL dos poços das amostras que tiveram inibição e estriados em placas de Petri com ágar padrão para contagem (PCA) e incubados por 24 h a 37 °C. Será considerada a CBM aquela correspondente às placas em que não houve crescimento bacteriano.

Simulação da digestão biológica simulada in vitro
Preparo da amostra
Para a determinação da simulação da digestão, as fibras de amido/ECP (500 mg) serão homogeneizadas em 2 mL de água deionizada. Desta solução será retirada uma alíquota de 600 µL para ser utilizada como controle (fração não digerida, em meio aquoso). Após, serão realizadas simulações da digestão nas condições da boca, estomago e intestino, de acordo com o método proposto por Gião et al. (2012) e Fonseca et al. (2020).

Simulação da digestão na boca
As amostras serão homogeneizadas com 600 µL de solução de α-amilase (100 U.mL-1) tipo IX-A (Sigma-Aldrich, CAS 9000-90-2) e agitadas em banho a 37 °C por 1 min. Após este processo, será retirada uma alíquota de 600 µL para a avaliação da digestão na boca por espectrofotometria. O restante da solução será utilizado para a continuação da simulação de digestão.

Simulação da digestão no estômago
A solução produzida pela simulação da digestão na boca terá seu pH ajustado para 2,0 usando HCl (1 mol.L-1) e após serão adicionados 750 µL de uma solução de pepsina (25 mg.mL-1 preparada com HCl 0,1 mol.L-1) (Sigma-Aldrich, CAS 9001-75-6), em seguida agitar-se-á em banho a 37 °C por 60 min. Após este processo, será retirada uma alíquota de 600 µL para a avaliação da digestão no estômago por espectrofotometria. O restante da solução será utilizado para a continuação da simulação de digestão.

Simulação da digestão no intestino
O pH da solução produzida pela simulação da digestão no estômago será ajustado para 6 com NaHCO3 (1 mol.L-1) e adicionar-se-á a 375 µL de solução de pancreatina (2 g/L in 1 M NaHCO3; Sigma Aldrich, CAS 8049-47-6) e sais biliares (12 g/L in 1 M NaHCO3; Sigma Aldrich) em seguida agitar-se-á em banho a 37 °C por 60 min. Após este processo será retirada uma alíquota de 600 µL para a avaliação da digestão no intestino por espectrofotometria.

Avaliação da digestão biológica
Após a coleta das amostras em todos os estágios as amostras serão avaliadas por espectrofotometria quanto ao teor compostos fenólicos totais, conforme descrito anteriormente.

Obter nanofibras de extratos ricos em compostos fenólicos provenientes de casca de pinhão utilizando como material de parede amido solúvel de batata via electrospinning, que apresentem alta atividade antimicrobiana e antioxidante e que promovam a liberação controlada dos compostos fenólicos.