Nome do Projeto
RT-LAMP: método molecular alternativo para monitoramento de infecções da COVID-19 em profissionais da saúde na região Sul do Brasil
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/06/2020 - 30/06/2022
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências da Saúde
Resumo
O número de casos de pacientes infectados com SARS-CoV-2 no mundo tem aumentado consideravelmente, atingindo até o presente momento cerca de 1.914.916 de casos já confirmados com 123.010 óbitos. No Brasil, já foram evidenciados até o presente momento, 25.262 casos confirmados com 1532 óbitos, sendo que o Rio Grande do Sul, tem contribuído com cerca de 747 casos e 19 óbitos. Com o aumento dos número de casos em todo o mundo e a necessidade de diagnóstico confirmatório, existe uma escassez de insumos disponíveis no mercado internacional para a realização da confirmação dessa infecção pela técnica de RT-qPCR. Um dos pontos de controle populacional da transmissão das infecções da SARS-CoV-2, e que vem sendo negligenciada pelos governos estaduais e federal são os profissionais da área saúde. Tais profissionais estão na linha de frente ao enfrentamento da COVID-19 e deveriam ser monitorados através de testagem sistemática e periódica. Uma limitação para que isso ocorra é a falta de insumos para o teste confirmatório, esse último, de elevado custo para o governo e laboratórios. Novos métodos moleculares que sejam sensíveis, específicos, de menor custo e seguros devem ser considerados nesse momento. Acreditamos que o RT-LAMP, um método de amplificação isotérmica e colorimétrico, possa ser uma alternativa interessante para o monitoramento desses profissionais. Tal método apresenta sensibilidade comparável à RT-qPCR para detecção do SARS-CoV-2, sendo capaz de detectar menos de 10 cópias do vírus por amostra. Cabe ressaltar que este projeto vai ao encontro dos objetivos propostos pela força tarefa para o enfrentamento da COVID-19 na cidade de Pelotas/RS, conhecida como “Aliança Pelotas”. Esta força tarefa esta envolvida em dois grandes esforços, um relacionado ao abastecimento de alimentos na cidade e o outro relacionado à área da saúde. Na área da saúde a “Aliança Pelotas” está realizando uma campanha privada de suporte as ações públicas de saúde no município e que apresentam 4 etapas básicas: 1) testagem de profissionais da área da saúde, 2) arrecadação de EPIs para profissionais da área da saúde, 3) aquisição de respiradores e 4) aumento de número de leitos em UTIs nos hospitais da cidade. Com essa finalidade foi criado recentemente, um grupo de trabalho, composto por diferentes profissionais (UCPel e UFPel) para atuarem na realização de testes moleculares e testagem justamente de amostras dos profissionais da saúde com suspeita da COVID-19 no HUSFP-UCPel, HE-UFPel e nas UBS. Em um primeiro momento, a UCPel viabilizará de forma gratuita 1000 testes de RT-qPCR, sendo oferecido para as equipes médicas, de enfermeiros, técnicos de enfermagem, médicos, residentes que atuam no HUSFP-UCPel e UBS coordenadas pela UCPel. Já no HE-UFPel não esta prevista ainda tal ação, devido ao número limitado de testes oferecidos pela UCPel e também devido à necessidade de parceria público-privada para a viabilização da ação. Assim, o objetivo da presente proposta é detectar a presença de infecções por SARS-CoV-2 em swab de nasofaringe e amostras de saliva, oriundas de profissionais da área saúde na cidade de Pelotas/RS, utilizando o método alternativo de RT-LAMP.

Objetivo Geral

Detectar a presença de infecções por SARS-CoV-2 em swabs de nasofaringe e
amostras de saliva, oriundas de profissionais da área saúde na cidade de Pelotas/RS,
utilizando o método alternativo de RT-LAMP.

Justificativa

A COVID-19 tem provocado inquestionavelmente um grande impacto na saúde pública mundial. Tal impacto cresce de forma inversamente proporcional às condições socioeconômicas dos países se tornando uma importante causa de morbidade e mortalidade na população do grupo de risco. Recentemente, a COVID-19 tem se propagado em profissionais da área da saúde que atuam na linha de frente ao combate da pandemia. Estimativas apontam que aproximadamente 1400 profissionais já foram infectados no Brasil, sendo registrada até o presente momento 18 mortes. A prevenção da infecção por para a detecção do SARS-CoV-2 nesses profissionais requer diagnóstico rápido, para isolamento e remoção desses profissionais de suas atividades profissionais diárias, evitando a propagação e infecção de outras pessoas pelo vírus. O diagnóstico precoce do SARS-CoV-2 no surgimento dos primeiros sintomas do quadro viral é de sua importância. Tem sido empregada para a realização do diagnóstico viral métodos moleculares capazes de amplificar RNA viral extraído das amostras clínicas dos pacientes, técnica de RT-qPCR. Contudo, nesse semanário catastrófico que a pandemia tem provocado pelo mundo, existe uma diminuição de insumos utilizados para realizar esse diagnóstico uma vez que todos os países do mundo afetados pela pandemia procuram os mesmos insumos. Isso tem gerado um aumento no preço desses insumos, bem como, demora na liberação de resultados. Nesse contexto, com a utilização de um método alternativo, rápido, seguro, barato para a detecção da presença da para a detecção do SARS-CoV-2 em amostras clínicas se torna necessária. O método de RT-LAMP apresenta tais características, além de apresentar alta eficiência de amplificação. Nesse sentido, acreditamos que, caso essa proposta seja implantada, ela somará ao estado da arte sobre o diagnóstico rápido do SARS-CoV-2. A utilização da RTLAMP pode se tornar uma alternativa interessante para a realização do monitoramento dos profissionais da área da saúde que estão atuando na linha de frente em nossos hospitais. Além disso, por utilizar reagentes que não estão escassos no mercado, seu custo ser barato se comparado a RT-qPCR, essa alternativa se torna viável e real. Outro ponto favorável ao método é a facilidade de execução e implantação nos laboratórios. De forma global, portanto, esperamos que a RT-LAMP possa ser implantada na rotina laboratorial para o monitoramento das infecções de para a detecção do SARSCoV-2 nos profissionais da área da saúde durante essa pandemia. Tal fato, poderia impactar positivamente no processo de monitoramento desses profissionais, uma vez que, a técnica apresenta sensibilidade comparável à RT-qPCR, com custo de execução menor e com maior facilidade de aquisição de insumos.

Metodologia

4.1 Local de desenvolvimento do projeto
O projeto será desenvolvido no Laboratório de Pesquisa em Bioquímica e
Biologia Molecular de Micro-organismos (LaPeBBioM) do curso de Farmácia da
Universidade Federal de Pelotas (UFPel) em colaboração ao Laboratório de
Neurociências Clínicas da Universidade Católica de Pelotas (UCPel). Ambos os
laboratórios atuaram de forma direta na captação das amostras no HE-UFPel, HUSFPUCPel ou em uma das UBS do munícipio. O projeto também conta com a colaboração do Prof. Dr. Fernando Rosado Spilke do Laboratório de Virologia da Universidade FEEVALE. Para este laboratório serão enviadas amostras positivas no RT-LAMP e RTqPCR para validação cruzada dos resultados. As coletas serão realizadas durante o atendimento de rotina nos hospitais escola da UFPEL, HUSFP e UBS. O estudo terá duração de 12 meses a partir da assinatura do termo de outorga junto à agência de fomento.
4.2 Delineamento do estudo
Será conduzido um estudo transversal, prospectivo, que incluirá amostras de
conveniência, coletas de profissionais da área da saúde que estejam atuando na linha defrente ao combate do COVID-19 em dois hospitais da cidade de Pelotas/RS e em Unidades Básicas de Saúde (UBS) do município de Pelotas. Será aplicado um
questionário sócio-demográfico com itens de caracterização dos profissionais
participantes (sexo, idade, categoria profissional (enfermagem, técnicos em
enfermagem, médicos e categorias gerais, que inclui psicólogos, fisioterapeutas,
terapeutas ocupacionais e farmacêuticos), sintomas de infecção por SARS-CoV-2,
exposição ao SARS-CoV-2 e questões sobre a utilização de EPIs). Os critérios de
inclusão serão: 1) profissionais da área da saúde que desempenham suas funções em umdos dois hospitais ou nas Unidades Básicas de Saúde do município de Pelotas e queapresentem suspeita diagnóstica da COVID-19 ou com doença confirmada por meio deexames de triagem (bioquímicos e imagem), 2) aceite em participar do estudo por meio da concordância e assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE). Critérios de exclusão serão: 1) profissionais da área da saúde com infecções virais por
outros agentes etiológicos que não sejam por COVID-19 e com outras doenças de
acometimento do trato respiratório com testagem negativa para SARS-CoV-2 no RTPCR (nesse caso profissionais que trabalham no HUSFP-UCPel).

4.3 Amostras
Serão coletadas amostras de profissionais da área da saúde que desempenham
atividades nos hospitais HE-UFPel e HUSFP-UCPel ou em uma das Unidades Básicas
de Saúde do município de Pelotas que apresentem sintomas de infecção por SARSCoV-2, após o mesmo ter passado por avaliação médica, respondido questionário sóciodemográfico e assinado o TCLE. Serão coletados swab de nasofaringe (NSF) e de saliva, sendo usado protocolo padronizado de coleta, segundo recomendado pelo Ministério da Saúde (BRASIL, 2020). Inicialmente, serão coletadas cerca de 250 amostras de swab de nasofaringe e 250 de saliva no HE-UFPel e UBS do município. No total, o estudo prevê avaliar cerca de 500 amostras. Os materiais coletados serão imediatamente inativados e enviados ao laboratório para extração de RNA.
4.4 Extração do RNA viral
O RNA viral dos swabs de nasofaringe (NSF) e da saliva, bem como o controle
positivo (SARS-CoV-2 inativado, cedido gentilmente pelo Prof. Dr. Edison Durigon da
Universidade de São Paulo/USP) será extraído utilizando-se o kit MagMax™ core
nucleic acid purification (Applied Biosystens), de acordo com as instruções do
fabricante. Após a extração, os RNAs serão quantificados em NanoDrop (Thermo
Scientific, Waltham, MA). Uma concentração de aproximadamente 100 ng de RNA será utilizada para a realização do RT-LAMP ou RT-qPCR. Os RNAs após extração e uso, serão armazenados em freezer -80°C.
4.5 Transcrição reversa
O cDNA das amostras suspeitas serão confeccionados utilizando a enzima
SuperScript IV Reverse-Transcriptase (Invitrogen, Waltham, MA), seguindo as
instruções do fabricante com modificações. Resumidamente, serão utilizados 10 pmol de primers randômicos como iniciadores da transcrição reversa e as reações serão incubadas nas seguintes condições: 20 minutos a 25℃, 30 minutos a 55℃ e 10 minutos a 80℃.
4.6 Reação de RT-LAMP
A metodologia de LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) consiste em
um método alternativo para a amplificação de ácidos nucleicos (DNA/RNA) através de um processo isotérmico. O protocolo será realizado segundo PARK et al., 2020.
4.8 Aspectos Éticos
Serão obedecidos os critérios éticos estabelecidos pela resolução vigente do
Conselho Nacional de Ética em Pesquisa, Diretrizes e Normas Regulamentadoras de
Pesquisas Envolvendo Seres Humanos, garantindo o sigilo da identidade dos
participantes da pesquisa, bem como respeitando as normas de biossegurança. Os riscos a que os sujeitos da pesquisa estarão expostos serão o desconforto de realizar a coleta e o inconveniente de responderem o questionário sócio-demográfico. O benefício potencial do estudo será a possibilidade do desenvolvimento de um método diagnóstico mais rápido e barato para a detecção do SARS-CoV-2 comparado ao padrão ouro (RTqPCR). O projeto será submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da FAMED/UFPel. Todos os sujeitos da pesquisa, ou seus responsáveis, serão esclarecidos com relação aos procedimentos a serem realizados e ao sigilo dado às informações obtidas, através do termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE), o qual deverá ser assinado pelo
paciente ou por seu representante. A coleta de dados será iniciada após a aprovação do projeto pelo Comitê de Ética e estes permanecerão armazenados por cinco anos após o término deste estudo; após todos os formulários serão inutilizados. Todos os
pesquisadores envolvidos na pesquisa se comprometem a tratar com sigilo os dados
coletados.
4.9 Análise Estatística dos dados
A média e o desvio padrão dos valores do tempo limite médio (Ttav) no RTLAMP dos profissionais testados serão utilizados para avaliar os grupos de profissionais
acometidos de acordo com os dados sócio-dermograficos utilizados. Serão determinadas as diferenças na prevalência dos profissionais infectados pelo para a detecção do SARSCoV-2 e testados pelo método RT-LAMP. Também será avaliado por método comparativo a concordância existente entre os resultados positivos dos swabs de nasofaringe e as amostras de saliva. Os cálculos estatísticos serão realizados usando SPSS 18.0.1 - pacote estatístico (SPSS Inc, Chicago).

Indicadores, Metas e Resultados

Desenvolver e testar metodologia molecular alternativa, baseada no método de RTLAMP, para a detecção e monitoramento das infecções por SARS-CoV-2 em
profissionais da área da saúde;
Determinar a percentagem de profissionais da área de saúde com sintomas
respiratórios positivos para COVID-19 em ambos os hospitais e nas UBS do município
de Pelotas;
Comparar a sensibilidade do uso de swab de nasorafinge versus amostras de saliva
para o diagnóstico molecular do SARS-CoV-2 utilizando RT-LAMP;
Determinar o custo benefício da nova metodologia (RT-LAMP) em comparação com
RT-qPCR;
Rever os dados obtidos, comparando-os aos dados publicados sobre a prevalência da COVID-19 em profissionais da área da saúde no RS e Brasil;
Investigar a possível causa de contágio com SARS-CoV-2 desses profissionais e
avaliar se os mesmos disponham dos Equipamentos de Proteção Individual (EPIs) dnoperíodo prévio ao contágio;
Publicar os dados obtidos em revistas científicas e divulgar resultados em congressos e eventos nacionais ou internacionais.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
CLAUDIO MARTIN PEREIRA DE PEREIRA1
CRISTIANE LUCHESE1
ETHEL ANTUNES WILHELM1
FERNANDA NEDEL
FERNANDA PEDROTTI MOREIRA
Gabriele Cordenonzi Ghisleni
JANICE LUEHRING GIONGO
MAGDA ROSIANE ROCHA DE ARAUJO
MILENA MATTES CERVEIRA
PAULO MAXIMILIANO CORREA1
RODRIGO DE ALMEIDA VAUCHER4
Victor dos Santos Barboza

Fontes Financiadoras

Sigla / NomeValorAdministrador
FAPERGS / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado Rio Grande do SulR$ 57.819,20Coordenador
CAPES / Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível SuperiorR$ 4.000,00Coordenador

Plano de Aplicação de Despesas

DescriçãoValor
Material de laboratórioR$ 35.819,20
Equipamentos e material permanente (móveis, máquinas, livros, aparelhos etc.)R$ 22.000,00

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