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Os pacientes com hipotireoidismo são geralmente tratados através de administração de T4 para reestabelecer os hormônios a valores normais e o tratamento é necessário durante toda a vida. A dose deve ser individualizada e periodicamente avaliada através de exames clínicos e análises hormonais, pois as necessidades podem variar ao longo do tempo (LONGMORE, 2007). Dessa forma, devido à heterogeneidade da resposta alguns pacientes podem não responder bem ao tratamento ou apresentar efeitos indesejáveis (LONGMORE, 2007; TYERNEY, et al., 2009). Assim, o acompanhamento desses pacientes é de fundamental importância já que os distúrbios tireoidianos também têm sido associados às alterações cardiovasculares e às doenças que acometem o SNC, as quais demandam grandes cuidados com a saúde dos acometidos.
Assim, torna-se necessário investir em pesquisas que visem elucidar as alterações que ocorrem no hipotireoidismo. O complexo multienzimático das ectoenzimas (NTPDase, 5’-nucleotidase e ADA) constitui uma cascata altamente organizada com uma importante função na manutenção da hemostasia normal e na neurotransmissão purinérgica, principalmente por regular o catabolismo do ATP, considerado um importante neurotransmissor, e a produção de adenosina, uma molécula com propriedades anti-inflamatórias. Estando os sistemas purinérgico e colinérgico envolvidos em muitos dos mecanismos das alterações fisiológicas apresentadas por pacientes com desordens tireoidianas, torna-se relevante um estudo da expressão das enzimas que hidrolisam nucleotídeos e nucleosídeos de adenina, os receptores do sistema purinérgico e a relação com o estresse oxidativo e seus marcadores, além da expressão da enzima AChE e receptores de ACh em modelos experimentais de hipotireoidismo, o que pode auxiliar a esclarecer os mecanismos envolvidos, beneficiando pacientes com esta endocrinopatia. Além disso, devido à busca de alternativas que auxiliem no tratamento e atenuação dos sintomas causados por essas desordens, a avaliação do tratamento com os extratos naturais de Vaccinium virgatum, Rubus sp e Eugenia uniflora e com o polifenol resveratrol almeja buscar novas moléculas que possam auxiliar na terapia dos distúrbios tireoidianos.

4.1 Animais
Serão utilizados ratos Wistar machos adultos, provenientes do Biotério Central da UFPel. Para o primeiro experimento os animais serão divididos em 9 grupos experimentais: controle água, controle resveratrol (50mg/Kg), controle extrato de Vaccinium virgatum (100mg/Kg), controle extrato de Vaccinium virgatum (200mg/Kg), hipotireoidismo, hipotireoidismo + T4 (2µg/Kg) e hipotireoidismo + resveratrol (50mg/Kg), hipotireoidismo + extrato de Vaccinium virgatum (100mg/Kg), hipotireoidismo + extrato de Vaccinium virgatum (200mg/Kg) (n=10), totalizando 90 animais. Para o segundo experimento os animais serão divididos em 10 grupos experimentais: controle água, controle extrato de Rubus sp (100mg/Kg), controle extrato de Rubus sp (200mg/Kg), controle extrato de Eugenia uniflora (100mg/Kg), controle extrato de Eugenia uniflora (200mg/Kg), hipotireoidismo, hipotireoidismo + extrato de Rubus sp (100mg/Kg), hipotireoidismo + extrato de Rubus sp (200mg/Kg), e hipotireoidismo + extrato de Eugenia uniflora (100mg/Kg) e hipotireoidismo + extrato de Eugenia uniflora (200mg/Kg) (n=10), totalizando 100 animais, e serão mantidos a uma temperatura constante (23 ± 1 ° C), com ciclo claro/escuro de 12h, acesso livre a alimentos e água ou solução de metimazol. Além da observação de estudos da literatura, realizamos o cálculo amostral utilizando o programa GPower, onde, constatamos a necessidade desse n para cada experimento.
Os cuidados com os animais seguirão a Diretriz Brasileira para o Cuidado e a Utilização de Animais em Atividades de Ensino ou de Pesquisa Científica – CONCEA, tendo o projeto obtido aprovação pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Pelotas, CEEA nº 12594-2020.

4.2 Indução experimental de hipotireoidismo e tratamento com extratos e resveratrol
Para induzir o hipotireoidismo, o fármaco antitireoidiano Metimazol (MTZ) será administrado ad libitum na água de beber a uma concentração de 20 mg/100 mL durante 45 dias de tratamento (BALDISSARELLI et al., 2016). Durante este período, os animais do grupo controle receberão apenas água pura.
Além do metimazol, o grupo hipotireoidismo + T4 receberá L-Tiroxina (2 μg/Kg), via gavagem oral (GAO et al., 2015), o grupo hipotireoidismo + resveratrol receberá resveratrol (50mg/Kg), via gavagem oral (YEN et al., 2017; JIANG et al., 2017) e os animais dos grupos controle + extrato e hipotireoidismo + extrato receberão 100mg/Kg ou 200mg/Kg do respectivo extrato, via gavagem oral, durante os 45 dias de experimento (SPOHR et al., 2018). Os animais do grupo controle e hipotireoidismo receberão apenas solução salina. A O volume administrado será de 0,1 mL/100g de peso de rato.
Após 6 semanas de tratamento, os animais serão eutanasiados, o sangue total colhido por punção cardíaca e o cérebro dissecado para posterior utilização nos testes. A indução de hipotireoidismo será confirmada por imunoensaio enzimático (AxSYM ®), onde TT3 é expresso como ng/mL de plasma, tT4 como μg/mL de plasma e TSH como μUI/mL de plasma (SUBUDHI, et al., 2008; DIAS et al., 2012).

4.3 Separação de plaquetas
As plaquetas serão preparadas pelo método de Pilla et al. (1996) modificado por Lunkes et al. (2004). O sangue total será coletado em frascos com citrato de sódio como anticoagulante. Este sistema sangue total-citrato será centrifugado a 600 rpm for 10 min para remover os resíduos de células sanguíneas. O plasma rico em plaquetas (PRP) será centrifugado a 3700 rpm com tampão de HEPES isomolar 3,5mM contendo NaCl 142mM, KCl 2,5mM e glicose 5,5mM por 30 min. As plaquetas lavadas serão ressuspendidas no tampão de HEPES isomolar e utilizadas para os ensaios enzimáticos.

4.4 Preparação de fração sinaptossomal cerebral
Os sinaptossomas cerebrais serão preparados como descrito por NAGY & DELGADO ESCUETA (1984) usando um gradiente descontínuo de Percoll. A integridade sinaptossomal será medida pelo ensaio da enzima lactato desidrogenase e considerada viável quando tiver um rompimento inferior a 10% (SCHETINGER et al., 2001).

4.5 Ensaio das enzimas Acetilcolinesterase e Butirilcolinesterase
O ensaio enzimático da AChE em estruturas encefálicas e BUChE em soro serão determinados como descrito por Ellman et al., (1961) com pequenas modificações (ROCHA et al., 1993). O método é baseado na formação do ânion amarelo, 5,5 '-ditio-bis-nitrobenzóico ácido, medido por absorbância a 412 nm durante a incubação 2min a 25 ° C. A atividade específica será expressa em µmo del AcSCh/h/mg de proteína para acetilcolinesterase e µmol de BcSCh hidrolisada/h/mg de proteína.

4.6 Ensaio das enzimas NTPDase e ecto-5’-nucleotidase
As atividades das enzimas NTPDase e 5’-nucleotidase serão determinadas segundo Lunkes et al. (2004). A liberação de fosfato inorgânico (Pi) será determinada pelo método de Chan et al. (1986) usando verde malaquita como reagente colorimétrico e KH2PO4 como padrão, com modificações segundo Baldissarelli et al. (2017). Atividades enzimáticas específicas serão expressas como nmol de Pi liberado/min/mg de proteína.

4.7 Ensaio da enzima Adenosina desaminase (ADA)
A atividade da ADA será determinada de acordo com Guisti e Galanti (1984) com modificações. Os resultados serão expressos em U/L, onde uma unidade (1U) de ADA é definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 mmol de amônia por minuto a partir da adenosina em condições padrão de ensaio.

4.8 Expressão das enzimas por RT-PCR semiquantitativa
A expressão das ectoenzimas em tecido cerebral será realizada por reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa semiquantitativa (RT- PCR). O RNA total será extraído com Trizol (Invitrogen Corporation, Carlsbad, EUA). Posteriormente, o cDNA será sintetizado a partir de RNA total e oligo dT e utilizado como modelo para RT-PCR, com primers específicos para todas as enzimas analisadas. A β-actina-PCR será realizada como um controle para a síntese de cDNA. Os produtos da PCR serão separados por eletroforese com gel de agarose a 1%. As intensidades de banda serão analisadas de forma semiquantitativa usando o software ImageJ.

4.9 Densidade dos receptores purinérgicos e colinérgicos por Western blot
A avaliação da densidade dos receptores será realizada conforme descrito por Reichert et al. (2018). As amostras serão diluídas com tampão SDS-PAGE e separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida, sendo então eletrotransferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (0,45 m, Amersham). Em temperatura ambiente as membranas serão bloqueadas por 1 hora com 5% de albumina, e incubadas “overnight” a 4 °C com anticorpo monoclonal para P2X7, P2Y1, P2X1, P2Y12, A1 e A2A e α7 e M1. Após, as membranas serão lavadas três vezes com TBS-T, incubadas com anticorpo secundário conjugado à peroxidase (HRD) anti-rabbit, anti-rat e anti-mouse (Calbiochem) e finalmente incubadas com solução quimio-fluorescente e analisadas com um revelador de imagens ChemiDoc 3000 (Biorad).

4.10 Perfil Oxidativo
4.10.1 Determinação de espécies reativas (ER)
A formação de espécies reativas será estimada de acordo com ALI et al. (1992). Uma alíquota de tecido homogeneizado será incubada com 2', 7'-diclorofluoresceína-diacetato (DCFH-DA, 7 µM). A oxidação de DCFH-DA para diclorofluoresceína (DCF) será medida para a detecção de ER intracelulares. A intensidade de emissão de fluorescência de DCF será registrada a 525 e 488 nm de excitação 60 min após a adição de DCFH-DA no meio. A DCF oxidada será determinada utilizando uma curva padrão e os resultados serão expressos em nM DCF/mL soro ou nM DCF /mg de proteína para as estruturas cerebrais.

4.10.2 Determinação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)
A peroxidação lipídica em soro será estimada pela medição de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), como malondialdeído (MDA, a 532 nm) através do método de JENTZSCH et al. (1996) com modificações. Os resultados serão expressos como nmol de MDA/mL de soro ou nmol de MDA/mg de proteína para as estruturas cerebrais.

4.10.3 Determinação da carbonilação de proteínas
A carbonilação proteica será determinada segundo o método descrito por Levine et al. (1990). O método é baseado na quantificação da carbonilação de proteínas através da reação com 2,4- dinitrofenilhidrazina, em meio ácido, utilizando coeficiente de extinção molar (21 x 103/mol por cm). A intensidade de cor do sobrenadante será medida a 370 nm e expressa como nmol/mg de proteína.

4.10.4 Determinação dos níveis de ácido ascórbico
A determinação do conteúdo de ácido ascórbico em soro será realizada como descrito por Abdalla et al. (2014). O conteúdo de ácido ascórbico será determinado a 520 nm e expresso como g de ácido ascórbico/mL de soro.

4.10.5 Determinação dos níveis de tióis totais (TSH) e tióis não proteicos (NPSH)
Os níveis de tióis totais serão determinados de acordo com Ellman (1959). Os resultados serão expressos como mmol de TSH/mL de plasma ou mmol de TSH/mg de proteína para as estruturas cerebrais. Para a determinação de NPSH, 200 µL da amostra será precipitada com 200µL de ácido tricloroacético 10% seguido por centrifugação (1050 g, 10 min), o sobrenadante desta centrifugação será utilizado para análise. O ensaio colorimétrico será realizado em tampão de fosfato 1 M, pH 7,4. Os resultados serão expressos como mmol de NPSH/mL de plasma ou mmol de NPSH/mg de proteína.

4.11 Determinação de proteínas
O conteúdo proteico das amostras será determinado de acordo com Bradford (1976) para ensaio de atividade enzimática e pelo kit de BCA para o ensaio de Western Blot, ambos utilizando albumina de soro como padrão.

4.12 Análise estatística
Os dados serão avaliados por análise de variância (ANOVA) de uma ou duas vias seguida pelo teste post hoc adequado. Os resultados serão considerados significativos quando P < 0,05.

Espera-se contribuir para o entendimento das causas e progressão das alterações cerebrais e cardiovasculares que ocorrem concomitantemente com os distúrbios tireoidianos, além dos possíveis efeitos protetores dos extratos naturais e do resveratrol e, assim, possibilitar oportunidades de prevenção e melhora no prognóstico da doença. Além disso, compreender as respostas do sistema purinérgico e seu envolvimento no hipotireoidismo. Ainda, contribuir para o desenvolvimento da pesquisa no departamento e para a formação de graduandos e pós-graduandos através da realização deste trabalho e elaboração de resumos a serem apresentados em congressos nacionais e internacionais. Ao final do projeto, espera-se a publicação de artigos científicos em periódicos internacionais e a divulgação dos resultados também em linguagem de fácil entendimento para a sociedade e portadores de hipotireoidismo.