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Desde que a relação entre as reações luminosas da fotossíntese e a fluorescência da clorofila a emergiu, esta técnica passou a ser extensivamente utilizada como uma eficiente ferramenta na investigação das reações de transporte de elétrons dirigidas pela luz no complexo proteína-pigmento do fotossistema II (FSII) e tem se tornado importante tema de pesquisa na Fisiologia Vegetal. A técnica tem permitido a aquisição de importantes informações à cerca dos processos de dissipação fotoquímica e não-fotoquímica da energia de excitação que ocorrem nas membranas dos tilacóides em presença de luz. Além disso, a técnica é considerada dinâmica e de elevada sensibilidade, possibilitando, assim, a obtenção não-destrutiva e rápida de resultados com leitura de um grande número de amostras, em pouco tempo e, com alto grau de confiabilidade. O aparelho fotossintético das plantas é muito sensível ao estresse ambiental e mesmo pequenas alterações na sua estrutura e no seu funcionamento podem ser facilmente detectadas. Além disso, a técnica tem permitido uma avaliação muito apurada do estado funcional do aparato fotossintético, especificamente do fotossistema II (FSII). Desde seu início muitos relatos de alterações estruturais e funcionais do processo fotossintético em plantas submetidas a estresse por déficit hídrico, por encharcamento, por deficiências nutricionais, por níveis de irradiância, por exposição à radiação ultravioleta, por salinidade, por metais pesados e resíduos químicos no solo e por baixas e altas temperaturas foram apresentados. Por exemplo, observou-se que parâmetros da fluorescência da clorofila como o FS (fluorescência steady-state) constitui um bom indicador do declínio da condutância estomática, assimilação do CO2 e geração do quenching não-fotoquímico (NPQ) em plantas de uva (Vitis vinifera L.) submetida ao déficit hídrico. Durante o estresse hídrico severo, a relação FS/FO reduz-se marcadamente, sendo sugerido seu uso em programas de irrigação para determinar o momento ideal de fornecimento de água à cultura. Desse modo, seria possível manter a cultura no limite entre o estresse hídrico e o consumo exacerbado de água (consumo de “luxúria”), gerando uso racional dos recursos hídricos. No mesmo contexto prático, o cruzamento entre cultivares de trigo com alta capacidade de produção (Jing 411) e com alta tolerância à fotoinibição (Xiaoyan-54) gerou um híbrido (1-12) com alta eficiência fotoquímica máxima e atual do FSII (FV/FM e ΦPSII, respectivamente). Em face às observações, o estudo da fluorescência da clorofila torna-se um importante tema da Fisiologia Vegetal, tanto em pesquisa básica quanto aplicada. Induções da fluorescência da clorofila podem ser estimadas usando-se fluorômetros portáteis apropriados, diferindo nas características de detecção dos sinais de fluorescência. De forma geral, a curva de indução da fluorescência é caracterizada por um rápido aumento da fluorescência de um nível basal (F0) a um nível máximo conhecido como fluorescência máxima (FM), obtido após incidência de luz branca saturante. Neste aumento da fluorescência ao nível M apenas o FSII está envolvido. Este processo é referido como fluorescência rápida da clorofila. Com a gradual fluência dos elétrons em direção ao FSI, através do complexo citrocromo b6f e da plastocianina, ocorre um gradual declínio de FM até um nível estável, conhecido como FS. A subseqüente aplicação de flashes de luz saturante permite uma análise mais refinada dos processos de extinção fotoquímicos e não-fotoquímicos da energia de excitação (“quenching”) e caracteriza o que se chama de fluorescência lenta da clorofila. Em resposta aos diversos fatores de estresse mencionados anteriormente, o aumento rápido da fluorescência da clorofila até o ponto M (FM) apresenta-se polifásico ou transiente, onde é possível identificar pontos específicos chamados O-J-I-P. Esses pontos são obtidos aproximadamente a 50 μs, 2 μs, 30 μs e 300 ms, respectivamente, após a incidência de luz na amostra. Sua amplitude pode estar diretamente ligada à intensidade e duração do estresse. A aparência polifásica da curva de indução da fluorescência da clorofila é um tema complexo e atualmente tem sido objeto de intensa pesquisa na área de Fisiologia Vegetal e biofísica. Geralmente, o significado biológico do aumento transiente da fluorescência da clorofila tem sido investigado com o uso de inibidores específicos da cadeia de transporte de elétrons associado a modelos matemáticos hipotéticos. O aumento transiente da fluorescência da clorofila reflete um acúmulo de estados redox específicos dos transportadores de elétrons do FSII (lado aceptor do FSII). Autores sugerem que o ponto J é reflexo do acúmulo de plastoquinona A reduzida (QA-) e que os pontos I e P representem uma redução parcial e total do pool de plastoquinonas B (QB- e QB2-), respectivamente, em adição ao acúmulo de QA-. Porém, não apenas o lado aceptor é afetado, mas também o estado funcional do lado doador do FSII (complexo de evolução do oxigênio) (POSPÍŠIL & DAU, 2000). Nesta perspectiva, sugere-se que a fase O-J seja influenciada pelo estado de oxidação “S” do complexo de evolução do oxigênio e que a fase I-J seja inibida por tratamentos que afetem negativamente o complexo de evolução do oxigênio. Estudos recentes também mostraram que em folhas submetidas a altas temperaturas ocorre uma conversão da curva O-J-I-P em O-K-P, caracterizada pelo aparecimento de um ponto adicional K. Foi observado que o ponto K surgia aos 300 μs de irradiação e provavelmente estaria relacionado aos eventos de inibição do lado doador de elétrons do FSII ligado ao complexo de evolução do oxigênio. Esse novo ponto corresponderia à resposta a condições de estresse tais como salinidade, déficit hídrico, temperatura e. Contudo, em algumas situações, o surgimento do ponto K pode refletir na total supressão dos pontos I e J, além de grandes variações na amplitude do ponto P. Plantas de cevada submetidas a pulsos de calor de 40 e 50ºC, mantidas na luz e no escuro por diferentes períodos de tempo, mostraram um pequeno aumento na amplitude do ponto O após 48 horas da aplicação dos pulsos. Entretanto, o ponto K desapareceu completamente após 4 horas da aplicação dos pulsos nas folhas mantidas na luz, mas persistiu nas folhas mantidas no escuro. Além do mais, a intensidade do ponto O diminuiu significativamente após 4 horas do tratamento nas folhas mantidas na luz e foi evidente 24 horas após aplicação dos pulsos nas folhas mantidas no escuro. Efeitos da temperatura na forma da curva OJIP também foram observados no decorrer do desenvolvimento de folhas de olmo (Ulmus pumilas) e, neste caso, os resultados foram relacionados à termoestabilidade do lado doador do FSII. Em plantas de feijão da China (Vigna radiata L.) e mostarda parda (Brassica juncea Coss.) com seis dias de idade, foram observadas alterações expressivas na amplitude dos pontos O-J-I-P após 3 dias de tratamento com NaCl. Concentrações acima de 200 mM suprimiram completamente os pontos O-J-I-P em Vigna radiata. Porém, em Brassica juncea, estas mesmas concentrações alteraram com menor amplitude cada ponto da curva. A variabilidade de respostas da curva O-J-I-P em relação aos diferentes fatores de estresse pode ser resultado da interação entre cada um desses estresses, o que exige cautela na interpretação dos resultados obtidos e um conhecimento prévio e claro à cerca dos possíveis significados biológicos de tais variações. Outro importante aspecto a ser destacado é a necessidade da investigação cuidadosa dos efeitos de diferentes condições de estresse sobre a indução da fluorescência da clorofila (curva transiente OJIP) utilizando diferentes espécies, confrontando entre si os resultados obtidos, haja vista que diferentes espécies vegetais submetidas às mesmas condições do meio podem apresentar respostas muito distintas.

Este projeto de pesquisa continuará sendo será desenvolvido no Laboratório de Metabolismo Vegetal do Departamento de Botânica do Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas (UFPel) podendo haver a participação de professores do Laboratório de Ecofisiologia Vegetal do Setor de Botânica (Departamento de Ciências Biológicas) da Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória-ES. As espécies utilizadas continuação sendo as mesmas já utilizadas.
Avaliação da cinética de emissão da fluorescência transiente ou polifásica (O-J-I-P)
A emissão da fluorescência da clorofila a será medida em folhas jovens totalmente expandidas, utilizando-se um fluorômetro portátil (HandyPEA, Hanstech, King’s Lynn, Norkfolk, UK). As medidas serão realizadas no período da manhã em folhas previamente adaptada ao escuro, por um período suficiente para a oxidação completa do sistema fotossintético de transporte de elétrons. Logo após, as folhas serão submetidas a um flash de luz saturante, valor determinado após realização de uma curva de saturação. As medidas terão uma duração de 5 e 180s da emissão de fluorescência em cada repetição, de modo a se obter os resultados da fluorescência rápida e da fluorescência lenta.
Serão avaliadas as variáveis derivadas da curva de emissão de fluorescência rápida: fluorescência inicial ou basal, F0, medida a 50µs; a fluorescência máxima, FM; e a fluorescência variável, FV, que representa a diferença entre FM e F0. Na análise da fluorescência lenta será obtido o valor da fluorescência terminal ou “steady-state” (FS), calculado como o decréscimo da fluorescência lenta, FD, (FD = FM - FS). Também será possível analisar a razão de diminuição de emissão de fluorescência, RFd, que pode ser expressa por (FM/FS)-1 ou pela fórmula FD/FS. (LICHTENTHALER et al., 2005). Ainda, serão analisadas as razões de rendimento quântico máximo do FSII, φP0, (TR0/ABS = FV/FM) e o rendimento quântico efetivo de conversão da energia fotoquímica, FV/F0. As variáveis biofísicas que quantificam o fluxo de energia através do FSII serão analisadas segundo o teste proposto por Strasser e Strasser em 1995 (apud FORCE et al., 2003), o teste JIP. Assim, o fluxo especifico de absorção de energia luminosa, ABS/RC, que é calculado a partir do número total de fótons absorvidos pelas moléculas de todos os RCs dividido pelo número total de RC ativos, representando o tamanho real da antena de um centro de reação ativo; o fluxo especifico de captura de energia de excitação, TR0/RC, ou taxa de captura máxima do FSII, trata-se da taxa máxima com que a energia de excitação é capturada pelo RC resultando na redução de QA (QA¬+ QA-); o fluxo especifico de dissipação da energia ao nível das clorofilas da antena, DI0/RC, representa a razão da dissipação total de energia de excitação não capturada nos RCs pelo número de RCs ativos; o transporte de elétrons excitados, ET0/RC, considera a reoxidação de QA- através da cadeia de elétrons por sessão transversal de RCs ativos e inativos; índice de centros de reação ativos por sessão transversal excitada, RC/CS0; e a probabilidade de transporte de elétrons, ET0/TR0, que indica a probabilidade de um elétron que esteja no aceptor QA entrar na cadeia de elétrons, serão analisados (FORCE et al., 2003).
Avaliação da fotossíntese (trocas gasosas e assimilação líquida do CO2)
Os parâmetros da fotossíntese serão determinados em folhas jovens completamente desenvolvidas, utilizando-se um analisador de gás no infravermelho IRGA (LCI System, ADC). Serão avaliadas as variáveis: assimilação de CO2 (A, mol m-2 s-1), transpiração (E, mmol m-2 s-1), condutância estomática (gs, mol m-2 s-1), concentração intercelular de CO2 (Ci, mol mol-1), temperatura foliar (Tf, ºC) e diferença de vapor entre a folha e o ar (DPVfolha-ar, KPa). A partir destas variáveis serão calculadas a eficiência instantânea de carboxilação (A/Ci, µmol m-2 s-1 Pa-1) e as eficiências de uso da água: A/E (µmol mmol-1) e A/gs (µmol mol-1) sendo esta última denominada eficiência intrínseca do uso da água por considerar o mecanismo estomático (MACHADO et al., 2005).
Avaliação dos teores de pigmentos fotossintéticos
Os teores de clorofila serão determinados utilizando-se um medidor portátil de clorofila SPAD-502 (Minolta Camera Co. Ltd.) e pelo método espectrofotométrico com extração em acetona 80% (Arnon, 1949). Os teores de clorofila a, b, total e de pigmentos carotenóides serão expressos em µmol g matéria fresca-1.

Crescimento e Produtividade
Para avaliar o crescimento das plantas, as variáveis adotadas serão: altura da planta: medida com régua milimetrada, partindo do colo das plantas até a gema apical; diâmetro do caule: medido no colo da planta com paquímetro, expresso em milímetros; número de folhas: obtido por contagem direta; matérias secas de raiz e parte aérea: a parte aérea e as raízes serão acondicionadas separadamente em sacos de papel e secas em estufa de ar circulado, a 70 °C, até massa constante, devidamente separadas por tratamento. As amostras serão pesadas em balança de precisão, expressas em gramas.
Quando as plantas entrarem na fase reprodutiva serão avaliados os índices de produtividade: número de folhas x planta, número de frutos x planta, número de frutos x número de folhas x planta (MARTINS E COSTA, 2003).

Ensaios em Casa de Vegetação
O cultivo das plantas, em casa-de-vegetação desde a semeadura, se dará em hidroponia de três fases (solução nutritiva + ar + substrato sólido) em vasos plásticos com capacidade adequada para os experimentos propostos. Os efeitos dos estresses por temperatura, por déficit hídrico e nutricional (incluindo a simulação da aplicação de herbicidas) serão monitorados por um período de até 90 dias (dependendo do ciclo de vida da cultivar analisada).
- Avaliação do estresse nutricional
Serão avaliadas as resposta à deficiência dos macronutrientes nitrogênio, fósforo e potássio em plantas cultivadas em condições de casa de vegetação. As plantas serão regadas com solução nutritiva de Hoagland (pH 6 - 6,5) deficientes dos nutrientes N, P e K. Três semanas após o início da aplicação do estresse, serão realizadas análises fisiológicas.
- Avaliação do estresse salinidade
Neste experimento, os efeitos do estresse salino sobre a curva de indução da fluorescência da clorofila serão avaliados. As plantas serão cultivadas em vasos plásticos com substrato isento de nutrientes (areia lavada). Diferentes concentrações de NaCl serão adicionadas à solução nutritiva de Hoagland (pH 6 - 6,5), sendo o controle regado apenas com a solução nutritiva. A curva de indução transiente da fluorescência da clorofila será obtida de acordo como descrito acima após três semanas após o início da aplicação do sal.
- Efeitos da temperatura sobre a indução da fluorescência transiente
Os efeitos da amplitude da temperatura (dia/noite) sobre a indução da fluorescência transiente serão avaliados em plantas cultivadas em vasos plásticos com areia como substrato. As plantas serão separadas em dois tratamentos: o tratamento controle – com plantas crescidas a temperatura ambiente; e tratamento com baixa temperatura – as plantas serão transferidas à noite para uma câmara fria (12°C) (STRAUSS et al, 2006) sendo mantidas durante o dia na temperatura ambiente. Os resultados serão comparados entre os tratamentos a fim de estabelecer o efeito da amplitude da temperatura sob a curva de indução.
-.Efeitos do déficit hídrico sobre a indução transiente da fluorescência da clorofila
Para a caracterização da curva OJIP em tecidos vegetais submetidos ao déficit hídrico, plantas serão previamente cultivadas em vasos plásticos contendo solo com níveis de nutrientes suficientes para a manutenção do seu crescimento e desenvolvimento. Após o estabelecimento das plantas o fornecimento de água será interrompido. Os efeitos do déficit hídrico sobre a fluorescência transiente serão registrados diariamente durante 14 dias em associação com medidas da fluorescência modulada e uso de inibidores de fluxo de elétrons. Em seguida, será retomado o fornecimento de água para as plantas e nova coleta de dados será efetuada para se verificar a capacidade de recuperação das reações luminosas da fotossíntese mediante análise da curva de indução da fluorescência da clorofila.
Efeitos de metais pesados sobre a indução transiente da fluorescência das clorofilas
Serão testadas concentrações de metais pesados (Pb, Cu e Zn) sobre a indução transiente da fluorescência da clorofila. As plantas serão cultivadas em vasos plásticos preenchidos com areia lavada, mantidos em casa de vegetação, e regados com solução nutritiva de Hoagland (pH 6 - 6,5) acrescidas de diferentes concentrações (mM) de cobre (como CuCl2), chumbo (como PbCl2) e de zinco (como ZnCl2) sendo o controle regado apenas com a solução nutritiva. A curva de indução transiente da fluorescência da clorofila será obtida conforme descrito acima após três semanas após o início da aplicação do estresse. Simultaneamente, medidas da fluorescência modulada do FSII serão feitas em associação com inibidores do fluxo de elétrons, quando pertinente.

METAS
Disponibilizar as informações sobre a utilização da curva de emissão da fluorescência transiente como ferramenta para promoção de maior produtividade e indicadoras de estresses ambientais
Difusão da técnica da fluorescência da clorofila a como uma metodologia não destrutiva no monitoramento do estado fisiológico dos vegetais;
Consolidação da linha de pesquisa relacionada aos estudos dos efeitos de estresses abióticos
Publicação de artigos científicos;
Formação de recursos humanos voltados a área de fisiologia vegetal

INDICADORES
numero de espécies avaliadas
número de estresse avaliados
número de artigos publicados

RESULTADOS
Este projeto de pesquisa tem como meta principal elevar o conhecimento científico sobre as espécies tropicais e temperadas. Os novos conhecimentos poderão subsidiar a sociedade produtora com informações que facilitem a implantação e o manejo de culturas. O aumento da produção por meio da escolha correta do material genético empregado e dos tratos culturais adequados serão as conseqüências de tal conhecimento.
Caberá à parte básica deste projeto, registrar as novas informações adquiridas e levá-las até sociedade produtora. Esta, por sua vez, as empregará no sentido de não somente aumentar a produção, mas também contribuir para o aumento na demanda por mão-de-obra especializada (o que resultaria em investimentos na formação do trabalhador), no aumento na arrecadação de impostos e aumento nos investimentos destinados à agricultura.