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A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), órgão responsável por moderar as Comissões de Controle de Infecção Hospitalar (CCIH) no Brasil, desde 2004, considera o uso da expressão IRAS para denominar a Infecção Relacionada à Assistência à Saúde. As IRAS são um grave problema de saúde pública em todo o mundo e correspondem à condição clínica, localizada ou sistêmica, resultante de reação adversa à presença de agente infeccioso ou toxinas produzidas pelo mesmo, em paciente atendido por serviço de saúde, e que não estava presente e nem em incubação no momento da admissão pelo serviço (MCKIBBEN et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2016). As IRAS geram impactos negativos como alta morbidade e mortalidade, internações hospitalares mais prolongadas e de maior custo, altas taxas de re-internação, maior tempo de tratamento com fármacos durante e após a alta hospitalar, além de serem responsáveis pela manutenção do risco de disseminação de micro-organismos resistentes aos antimicrobianos. Somado a isto, contribuem com 15 a 50% dos óbitos no ambiente hospitalar com repercussões para o usuário, seus familiares e a comunidade, evidenciado pelo afastamento da vida social e do trabalho, com consequente comprometimento psicológico, social e econômico (WHO, 2011).
As doenças infecciosas nas instituições de saúde e na comunidade, de países de alta e baixa renda, têm aumentado devido à resistência bacteriana aos antimicrobianos convencionais causada pelo uso excessivo e descontrolado destes medicamentos. A resistência dos micro-organismos patogênicos é um grande problema, pois as cepas multirresistentes (MMR - termo geralmente empregado quando os isolados são resistentes a três ou mais classes de antimicrobianos) são responsáveis por aproximadamente 50% das infecções hospitalares em todo o mundo (RICE, 2008; WHO, 2018). Alguns micro-organismos como Klebsiella pneumoniae e Acinetobacter baumannii são responsáveis pelo agravamento dessa situação devido a sua resistência a antimicrobianos anteriormente eficazes, dificultando assim o tratamento.
O gênero Klebsiella pertence à família Enterobacteriaceae, no qual se encontra a espécie K. pneumoniae. Estas são bactérias Gram negativas, em forma de bastonete, anaeróbias facultativas, imóveis e encapsuladas. São caracterizadas bioquimicamente por fermentarem a glicose, utilizarem o citrato como fonte de carbono, hidrolisarem a uréia, não produzem ácido sulfídrico,
são catalase positiva e oxidase negativa (KONEMAN et al., 1997; MURRAY et al., 2013). K. pneumoniae coloniza uma vasta gama de hospedeiros, variando de plantas a mamíferos, podendo também ser encontrada no solo e na água. Normalmente, indivíduos são portadores assintomáticos de K. pneumoniae, na pele, nariz e garganta. Em pessoas imunocomprometidas, neonatos e idosos, esta bactéria pode causar infecções hospitalares severas, como pneumonia e infecções do trato urinário (DOORDUIJN et al., 2016).
O gênero Acinetobacter, pertencente à família Moraxellaceae, abriga a espécie Acinetobacter baumannii, que são cocobacilos Gram negativos, ubíquos, aeróbios estritos, imóveis, não fastidiosos, não fermentadores de glicose, catalase-positivos e oxidase-negativos (PELEG et al, 2008). As bactérias podem ser recuperadas de diversas fontes como solo, água, produtos alimentares e ambientes médicos (TOMARAS et al, 2003). A identificação de A. baumannii compreende provas bioquímicas básicas, como a fermentação de glicose, redução de nitrato a nitrito, detecção de hemólise em Ágar Sangue, utilização de citrato e outras fontes de carbono (BOUVET & GRIMONT, 1986). A. baumannii é considerado um patógeno de baixa virulência, porém oportunista, pois pode provocar pneumonia, infecções do trato urinário, infecções respiratórias e meningite. É comumente encontrado na microbiota da pele humana, aparecendo também no ambiente hospitalar, onde algumas espécies foram isoladas de leitos, bancadas, equipamentos médicos, sistemas de circulação de ar e ventiladores (TJERNBERG; URSING, 1989; BERNARDS et al, 2004; DIJKSHOORN; NEMEC; SEIFERT, 2007; BARCHITTA et al, 2009), e ainda em água residual do ambiente hospitalar (CHAGAS et al, 2011).
A busca por novos antimicrobianos para superar a resistência crescente apresentada por estas bactérias tem sido uma das principais prioridades de pesquisa e desenvolvimento (P&D) em saúde pública. As plantas medicinais estão dentre os produtos naturais de grande interesse científico devido à possibilidade de empregá-las como fitofármacos, como também por apresentarem compostos metabólicos em sua estrutura (NASCIMENTO et al., 2000; PEREIRA; CARDOSO, 2012).
As plantas da família Myrtaceae têm apresentado expressiva atividade antimicrobiana frente a diferentes micro-organismos (BONA et al, 2014; SOLIMAN et al., 2016). O gênero Psidium é representado por 120 a 150 espécies, dentre elas P. cattleianum Sabine, também conhecido pelos nomes de araçá, araçá-do-mato, araçá-do-campo e araçá-amarelo (RASEIRA, 2004). Essa espécie é rica em compostos fenólicos, ácido ascórbico e carotenos, geralmente relacionados com propriedades biológicas importantes, tais como, o aumento da proteção contra oxidação celular, atividade antimicrobiana e anti-carcinogênica (PROTEGGENTE et al., 2002; SUN et al., 2002). A região Sul do Brasil é umas das três áreas do mundo a apresentar maior diversidade de plantas desse gênero, o que fomenta a realização de pesquisas para estimular economicamente e socialmente essa região (VANIN, 2015).
E. uniflora L. pertence à família Myrtaceae, e produz um fruto nativo do Brasil, conhecido popularmente como pitanga. Encontra-se disseminada, praticamente por todo o território nacional e em diversas partes do mundo, em função da adaptação às diferentes condições de solo e clima (LIRA JÚNIOR et al., 2007). O fruto e as folhas são fontes de compostos bioativos, oriundos do metabolismo secundário da planta, como compostos fenólicos, carotenóides e sesquiterpenos (LIMA; MÉLO; LIMA, 2002; AURICCHIO; BACCHI, 2003; LORENZI et al., 2006; LIRA et al., 2007; BEZERRA et al., 2012; MASSARIOLI et al., 2013), que possuem atividade antimicrobiana e efeitos benéficos à saúde humana.
Dentre os produtos naturais, procurados como alternativa aos fitofármacos, encontram-se os óleos essenciais (OEs), substâncias provenientes do metabolismo secundário de vegetais, sintetizadas com o propósito de conferir resistência a condições adversas como variações climáticas, ataques de insetos e micro-organismos. Para tal, são constituídos por muitas moléculas biologicamente ativas (KAVOOSI et al., 2013), e tais características conferem a estas substâncias propriedades diversas dentre as quais destacam-se a atividade antimicrobiana e antioxidante (SALGUEIRO, 2010).
As nanoemulsões têm ganhado atenção por parte das indústrias farmacêutica como sistemas de proteção e liberação de fármacos (MCCLEMENTS, 2012). As nanoemulsões são sistemas coloidais compostos de duas fases líquidas imiscíveis, nos quais uma fase encontra-se dispersa (interna) em outra contínua (externa), além disso, apresentam diâmetros que variam entre 100 a 500 nm. Esses carreadores são capazes de adsorver, encapsular, ou dispersar o fármaco em partículas nanométricas (LETCHFORD; BURT, 2007). As terapias de aerossol (terapia de inalação) têm sido utilizadas há anos e referem-se à entrega de um determinado composto terapêutico no organismo através da via respiratória. A vantagem do uso dos aerossóis reside na entrega de elevadas concentrações de compostos terapêuticos diretamente na zona alvo, com baixo risco de efeitos colaterais sistêmicos, além disso, apresentam rapidez com que estes chegam ao sítio de ação (AZEVEDO, 2010).
Assim, nanoemulsões com óleos essenciais de E. uiniflora L. e P. cattleianum S. inaláveis são promissoras na área da nanomedicina e aplicáveis no controle de infecções pulmonares, como no caso de pneumonia causada pelas bactérias K. pneumoniae e A. baumannii. Desta forma, estas bactérias podem ser controladas com compostos naturais, que apresentam efeitos colaterais bem menores que os antibacterianos convencionais, além disso, com o aumento de bactérias multi-drogas resistentes, principalmente no ambiente hospitalar, novas alternativas terapêuticas são necessárias.

COLETA E IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL VEGETAL: Folhas de plantas adultas de E. uniflora L. e P. cattleianum S. serão obtidas no pomar do Centro Agropecuário da Palma na BR 116 – Km 537, no município de Capão do Leão – RS, Brasil, localizada na latitude 31°48'13"S e longitude 52°30'30"W. As coletas do material vegetal serão realizadas manualmente neste pomar, que possui 100 plantas de E. uniflora L. e 50 de P. cattleianum S.. O mesmo será amostrado para o processo de conferência de exsicata, para posterior identificação e depósito no Herbário PEL lotado no Instituto de Biologia (IB), Departamento de Botânica da Universidade Federal de Pelotas (UFPel), Pelotas, Rio Grande do Sul. Além disso, os recursos naturais do presente projeto serão cadastrados na base eletrônica do Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SisGen).

MICRO-ORGANISMOS: serão utilizados para este projeto cepas padrão de K. pneumoniae ATCC 700603 e de A. baumannii ATCC 19606 cedidos pela Coleção de Micro-organismos da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) e isolados clínicos de K. pneumoniae e A. baumannii pertencente a bacterioteca do Laboratório de Biologia Molecular de Micro-organismos (LBMM-DEMP/IB/UFPel). Todos os micro-organismos já foram identificados bioquimicamente e molecularmente através da técnica de PCR utilizando genes espécie-específicos. As bactérias serão mantidas em meio conservação a -20ºC.

OBTENÇÃO DOS OEs: folhas de plantas adultas de E. uniflora L. e P. cattleianum S. serão coletadas e encaminhadas ao Laboratório de Pesquisa de Produtos Naturais (LPPN) no Centro de Ciências Químicas, Farmacêuticas e de Alimentos (CCQFA-UFPel) e submetidas à secagem em estufa com circulação e renovação de ar, a uma temperatura de 37°C. Após a secagem das folhas, os OEs serão obtidos a partir do material vegetal moído em moinho de facas. Em um balão, serão adicionadas 100g de folhas secas moídas, juntamente com 1000mL de água destilada para que os OEs sejam extraídos de acordo com a Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010), utilizando o processo de hidrodestilação por arraste a vapor, com o auxílio do equipamento Clevenger durante 4h. Após a extração, os OEs serão armazenados em frasco âmbar e mantidos à -20°C.

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DOS OEs: a identificação dos compostos químicos presentes nos OEs será realizada no LPPN/CCQFA-UFPel, seguindo o método de Santi et al. (2017), sendo os mesmos submetidos à análise cromatográfica em equipamentos de cromatografia gasosa acoplado com espectrofotometria de massa (GC-MS, Shimadzu QP2010) equipada com split e com uma coluna capilar Rtx-5MS Restek (30m x 0,25mm x 0,25 microns).

PREPARAÇÃO DAS NANOEMULSÕES: a preparação das nanoemulsões contendo OEs de E. uniflora L. e P. cattleianum S., seguirá o método proposto por Flores et al. (2011) e irá se basear na otimização do volume de ambas as fases durante a preparação (fases aquosa e orgânica).

PARÂMETROS FÍSICO-QUÍMICOS: Os parâmetros físico-químicos serão realizados conforme Flores et al. (2011).

TAMANHO DE PARTÍCULA, ÍNDICES DE POLIDISPERSÃO E ANÁLISE DO POTENCIAL ZETA: uma alíquota das amostras será diluída adequadamente em água purificada e após os tamanhos das partículas e os índices de polidispersão serão medidos por espectroscopia de correlação de fótons. Os valores do potencial zeta serão medidos utilizando o mesmo instrumento a 25ºC, após diluição das amostras em cloreto de sódio (NaCl) 10 mM.

DETERMINAÇÃO DE pH: os valores de pH das nanoemulsões serão determinados diretamente nas amostras utilizando um potenciômetro calibrado, à temperatura ambiente.

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ÓLEO: o teor total de óleo (%) nas formulações das nanoemulsões será determinado em triplicata por destilação de 25 mL de amostras por 3 h em aparelho de Clevenger.

ANÁLISES MORFOLÓGICAS: as análises morfológicas serão realizadas por microscopia eletrônica de transmissão, operando a 80kV. As amostras de nanoemulsões serão diluídas e depositadas em suporte de filmes de Form-Carbon em rede de amostras (Electron Microscopy Sciences), coradas negativamente com solução de acetato de uranila (2% w/v) e observadas a 150.000 de aumento.

ESTUDO DA PROTEÇÃO DA VOLATILIZAÇÃO DO OE: a influência da nanoencapsulação na evaporação dos OEs será avaliada a 37 ± 1ºC. As amostras (OE e nanoemulsões) serão aquecidas em banho-maria a temperatura de 35 a 37ºC por 15, 30 e 60min. Após, o conteúdo do OE será determinado por hidrodestilação, destilando 25mL de amostras por 3h em aparelho Clevenger (n = 3). O volume das amostras será coletado e pesado para calcular o óleo recuperado da amostra.

ESTUDOS DE ESTABILIDADE: As formulações serão monitorizadas após preparação por até 2 meses de armazenamento por tamanho médio, polidispersidade, potencial zeta e pH. O teor de óleo será determinado após 1 mês de armazenamento. As formulações serão embaladas em recipientes de vidro âmbar e armazenadas à temperatura ambiente (25 ± 2 ºC) e protegidas da luz.

CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM): Para determinar a CIM será utilizada a técnica de microdiluição em caldo de acordo com as normas instituídas pelo CLSI (2015), com modificações.

CONCENTRAÇÃO BACTERICIDA MÍNIMA (CBM): a partir dos resultados da CIM será determinada a CBM, que é definida como a menor concentração dos OEs ou das nanoemulsões onde pode ser observado crescimento visível na subcultura. Serão retiradas alíquotas de 5μL, de cada uma das cavidades do ensaio da CIM, que após 24h de incubação apresentaram inibição no crescimento bacteriano e em seguida, serão repicadas em placas de ágar BHI e incubadas a 37°C por 24h. A ausência de crescimento bacteriano no meio de cultivo indica que os OEs ou as nanoemulsões testadas não apresentam atividade bacteriostática e sim ação bactericida.

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBIOFILME DOS OEs LIVRES E DAS NANOEMULSÕES FRENTE AO BIOFILME PRÉ-FORMADO: as cepas padrão estudadas serão classificadas quanto a sua capacidade de formar biofilme de acordo com Stepanović et al. (2007).

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBIOFILME DOS OEs LIVRES E DAS NANOEMULSÕES FRENTE AO BIOFILME EM FORMAÇÃO: o protocolo do ensaio da atividade dos OEs no biofilme em formação será segundo Rodrigues (2017).

CINÉTICA DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA: um estudo da cinética será realizado para avaliar o efeito dos OEs que tiveram a CIM determinada (em concentrações de ¼ x MIC, ½ x MIC, 1 x MIC e 2 x MIC) sobre as cepas de K. pneumoniae e de A. baumannii, de acordo com a metodologia descrita acima para determinação da CIM.

ENSAIO TIME-KILL: o ensaio de time-kill será realizado para investigar a redução de viabilidade (redução de UFC/mL) causada pelos OEs de P. cattleianum S. e E. uniflora L. de acordo com a técnica utilizada por Ambrosio et al., 2018.

TESTE DE SINERGISMO UTILIZANDO OEs LIVRES E NANOEMULSÕES: para o teste de sinergismo será realizada uma combinação entre os produtos testados (OEs livres ou em nanoemulsões) e a microdiluição em caldo será feita de acordo com as normas padronizadas da CLSI, 2012.

TESTE DE CITOTOXICIDADE: para a avaliação do efeito citotóxico dos OEs e das nanoemulsões serão utilizadas células da linhagem Madin Darby Bovine Kidney (MDBK), pertencentes ao Laboratório de Virologia e Imunologia da Faculdade de Veterinária da UFPEL.

TRATAMENTO COM OS OEs E NANOEMULSÕES PRÉ e PÓS-INFECÇÃO: o modelo de pneumonia será estabelecido como descrito anteriormente, com pequenas modificações (CHIANG et al., 2009).

EXAME HISTOPATOLÓGICO PULMONAR: o pulmão direito será removido após a eutanásia do animal. O lobo superior do pulmão direito será fixado em solução de formalina a 10% e embebido em parafina. Após, serão realizados cortes com espessuras de 5μm e em seguida, as mesmas serão coradas com hematoxilina e eosina. As amostras serão analisadas em microscópio quanto à presença de lesões histopatológicas associadas com pneumonia (LI et al., 2016).

CONTAGEM BACTERIANA: o lobo inferior do pulmão direito dos animais (cerca de 0,5g) será misturado com 1ml de Phosphate Buffered Saline (PBS) usando um homogeneizador de vidro. Posteriormente, a partir dessa mistura serão realizadas diluições seriadas, que serão inoculadas em ágar LB, cultivadas a 37°C por 20h e a contagem realizada para determinação das UFCs (LI et al., 2016).

Os resultados obtidos serão submetidos à análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste Tukey (p≤0,05), com o auxílio do software BIOESTAT versão 5.0.

As plantas da família Myrtaceae se apresentam sob diferentes espécies com potencial atividade antimicrobiana, e deste modo, dado sua importância, duas plantas dessa família serão exploradas neste projeto. Neste estudo será realizada a extração e a caracterização físico-química de dois OEs, e então, a partir desses OEs serão preparadas duas nanoemulsões, as quais serão caracterizadas. Posteriormente, será realizado a CIM, com a intenção de alcançar a menor concentração capaz de inibir o crescimento microbiano. A partir desta análise, na CBM, será verificado se os OEs e as nanoemulsões apresentarão atividade bactericida ou bacteriostática. Além disso, será determinada a CABM contra o biofilme pré-formado e em formação dos dois OEs livres e das duas preparações de nanoemulsões, contra as duas cepas padrão testadas e causadoras de infecções pulmonares. Ademais, será analisada a cinética da atividade antimicrobiana e o tempo de morte das duas bactérias quando testadas frente aos dois OEs livres e as duas nanoemulsões. O sinergismo dos dois OEs testados serão avaliados, bem como, será realizado o estudo dos OEs e das nanoemulsões quanto ao efeito citotóxico em cultura de células mamíferas in vitro, tendo como meta detectar o potencial dos mesmos em produzir efeitos letais ou subletais em sistemas biológicos a nível celular. Por fim, será analisado o efeito antipneumonia in vivo dos dois OEs livres e das duas nanoemulsões administrados por via inalatória em grupos de seis camundongos infectados com as duas bactérias testadas de K. pneumoniae e de A. baumannii. Portanto, este projeto tem como meta desenvolver um produto eficiente no controle e na eliminação dos patógenos causadores de pneumonia.
Como resultado espera-se estabelecer que os OEs de P. cattleianum S. e de E. uniflora L. livres e em nanoemulsões tenham ação antibacteriana, assim como outras propriedades biológicas, podendo contribuir no tratamento da infecção pulmonar causada pelas bactérias A. baumannii e K. pneumoniae. Atualmente, fármacos disponíveis não se mostram efetivos para o controle das infecções hospitalares, devido a crescente multirresistência das bactérias. Não existindo um fármaco efetivo, com esse projeto, buscamos desenvolver um produto eficiente no controle e na eliminação dos patógenos causadores de pneumonia. Este projeto resultará em publicação de no mínimo dois artigos científicos em periódicos de interesse na área e de um artigo de revisão sobre alternativas terapêuticas naturais para infecções pulmonares. Além disso, possibilitará a divulgação dos dados em congressos científicos, treinamento de estudantes de graduação e pós-graduação e será utilizado como tese para obtenção do título de doutorado. Há ainda a expectativa de obtenção de um ou mais produtos para o controle e tratamento da pneumonia, os quais deverão ser protegidos através de patente.