Nome do Projeto
Desenvolvimento de um produto para prevenção de hipocalcemia
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
24/09/2020 - 24/09/2023
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
O cálcio é um dos principais minerais para a mantença da saúde, sendo responsável por diversas funções, tanto intra como extra celular. Na vaca leiteira apresenta um papel importante, uma vez que o mineral é necessário para a produção de leite, entretanto, muitas vezes a demanda deste mineral extrapola a capacidade de sua mobilização, podendo causar um transtorno conhecido como hipocalcemia. Está doença, caracterizada por baixas concentrações sanguíneas de cálcio, pode se apresentar em duas formas: Clínica, a qual apresenta os sinais clínicos da doença e subclínica, a qual apresenta uma redução nos níveis de cálcio entretanto não apresenta sinais. As estratégias de prevenção para esse transtorno se baseiam na manipulação da dieta do animal com a adição de sais aniônicos ou então redução de cálcio na dieta, ambos visando a estimulação dos mecanismos de homeostase do mineral, entretanto esses manejos requerem diversas aplicações, dificultando o manejo dos animais e o bem estar dos mesmos. Tendo isso em vista, o objetivo deste projeto é desenvolver um novo protocolo farmacêutico visando principalmente a redução de manejo com os animais e que seja capaz de recuperar rapidamente as concentrações séricas do mineral. Dois experimentos serão realizados, um primeiro os animais receberão por via intravenosa de um principio ativo (PA) para estimular a homeostasia do cálcio ainda no pré-parto. Serão realizadas coletas sanguíneas durante a aplicação do PA e até 72 horas após o inicio do tratamento, além de coletas no pós-parto até as 72 horas após o parto, tendo como objetivo verificar a eficácia do produto. No segundo experimento serão diferentes formas farmacêuticas, onde os animais serão acompanhados por 10 horas após a aplicação, este tendo por objetivo definir qual a melhor forma farmacêutica. Espera-se que ao final deste projeto se obtenha uma alternativa aos manejos utilizados para a prevenção do transtorno, reduzindo o número de manejos, bem como trazer um produto acessível para os pequenos produtores.

Objetivo Geral

O objetivo deste estudo é desenvolver uma estratégia farmacêutica para a prevenção de hipocalcemia em vacas leiteiras.

Justificativa

O cálcio é uma molécula de suma importância no organismo de ruminantes, principalmente de bovinos leiteiros. Estes animais apresentam uma grande necessidade deste mineral, principalmente em períodos reprodutivos. O cálcio representa cerca de 1,5% do peso do animal, distribuído principalmente entre os ossos e os dentes (Wilkens et al., 2012). É detentor de várias funções no organismo, principalmente com sustentação do animal, mas também atua em diversos fins intra e extracelularmente, como atividades celulares, secreções hormonais e processos de coagulação sanguínea e regulação da excitabilidade extracelular (Kimura et al., 2006; Martinez et al., 2012).
No periparto existe uma grande alteração das necessidades fisiológicas de cálcio, pois além da mantença do próprio animal, existe a necessidade de que a lactação, a gestação e a preparação hormonal para o parto sejam supridas. No pós-parto imediato, existe ainda, além de todos estes fatores a necessidade da produção de colostro.
O cálcio circulante permanece em equilíbrio dinâmico em várias formas, como a iônica (45- 50%), ligados a proteínas (40%) ou ligados a ânions de baixo peso molecular (10-15%) (Andriolo et al., 2004), e estas proporções são alteradas por diversos fatores, como pH, temperatura, aporte de moléculas de cálcio e de outros minerais.
Para tentar contornar esta situação, ao animal deve ativar seus mecanismos homeostáticos (Martinez et al., 2012), porém, existe a possibilidade de estes mecanismos pararem seu funcionamento, dependendo da severidade do nível que o animal se encontra. Neste ponto, inúmeras manifestações clínicas podem ocorrer (Goff, 2008).
Entre as enfermidades, a hipocalcemia, ou ainda chamada "febre do leite" pode apresentar-se como uma das mais importantes. Ela pode ser causada por uma diminuição nos níveis séricos de cálcio, que ocorrem principalmente no periparto dos animais (Brozos et al., 2011). A sua forma subclínica apresenta maior incidência, e devido a sua maior dificuldade de identificação e tratamento, pode ocasionar grandes perdas econômicas aos produtores.
Existem atualmente, estratégias comerciais que visam a prevenção da hipocalcemia, como o fornecimento de dietas para a manipulação do balanço catiônico-aniônico, visando a indução de uma queda no pH sanguíneo, que leva a um aumento na absorção intestinal e reabsorção renal de cálcio (Goff et al., 2014). Porém, as dietas podem ser pouco palatáveis, e podem causar uma diminuição na ingesta, o que poderia agravar o balanço energético negativo, predispondo a outras doenças (Chapinal et al., 2012). Outro fator de relevância é que estas dietas podem não ser viáveis economicamente, pois efetivamente não é realizada a estimativa real de consumo pelo animal, havendo assim uma pouca viabilidade financeira pelas perdas de produto.
Outras estratégias como dieta deficiente em cálcio, administração de calcitriol e o fornecimento de cálcio via oral, subcutânea ou intravenosas atendem essas necessidades, a sua maneira, porém são de difícil aplicabilidade prática e possuem efeitos secundários que acabam limitando seu uso nos sistemas produtivos.
Diante do exposto, é de suma importância que um novo produto ou modelo de prevenção da hipocalcemia seja desenvolvido, e que seja de fácil aplicabilidade, viável economicamente e que não agrida ao organismo animal.

Metodologia

O estudo traz o desenvolvimento de um adaptador metabólico para prevenção de hipocalcemia subclínica com aplicação ainda no pré-parto, capaz de ativar os mecanismos de homeostase após o parto, reduzindo a incidência da doença.
Para verificar a eficácia do produto, dois experimentos distintos serão realizados, um primeiro para verificar a eficácia do produto e outro para encontrar a melhor forma farmacêutica para o produto e sua farmacodinâmica.
O primeiro experimento irá ser realizado em uma propriedade leiteira ao sul do Rio Grande do Sul, no município de Rio Grande, nas coordenadas geográficas 32 º 16 'S, 52 ° 32' L. Serão selecionadas vacas da raça holandês, nulíparas em período gestacional. A alimentação será de acordo com o rebanho da propriedade, ambos os grupos receberão dieta aniônica.
As vacas serão distribuídas homogeneamente conforme o escore de condição corporal (ECC) na escala de 1 a 5 (Hady, Domecq e Kaneene, 1994), e serão divididos em 2 grupos (Produto e Controle) sendo estes subdivididos em dois grupos definido pela data de administração do produto, no grupo Produto, será administrado, uma solução do produto X aos 15 dias e 21 dias antes da data prevista para o parto, por um período de seis horas para promover uma hipocalcemia subclínica, mantendo as concentrações plasmáticas de cálcio ionizado ≤ 4,0 mg/dL durante esse periodo. O grupo controle (CON) receberá, pelo mesmo período de tempo dos grupos Produto, um placebo, contendo 0,9 % de NaCl. Todas as vacas serão submetidas a cateterização da veia marginal da orelha, anteriormente a isso será realizada a tricotomia e assepsia com solução de PVPI 2%. O vaso será puncionado utilizando o cateter intravenoso central 20G (BD I-Cathtm, BD, 1Becton Drive, Franklin Lakes, NJ/ USA), para os procedimentos de infusão do produto ou administração de placebo.
As coletas de sangue (10mL) serão realizadas por punção do complexo arterio-coccigeo, utilizando o sistema Vacutainer (BD Diagnostics, São Paulo, Brasil) em um tubo sem nenhuma solução, para obtenção de soro para as análises bioquímicas.
Vão ser coletadas amostras de sangue um dia antes da aplicação do produto x para obtermos o valor basal dos metabólitos. No dia da infusão da solução será coletado amostras de sangue, na hora zero, ou seja, antes da infusão e posteriormente de hora em hora durante as primeiras 10 horas, e após nas horas 12, 18, 24, 48 e 72 do início da infusão, para verificar a concentração sérica de cálcio ionizado (Cai) e cálcio total (Cat).
Para o monitoramento de hora em hora por 10 horas, e nas horas seguintes após a infusão, será utilizado o medidor bioquímico portátil I-STAT (Aboot) utilizando cartuchos GC+8.
No pós-parto, as amostras serão coletadas nas horas 0, 6 ,12, 24, 36, 48, 60 e 72 horas após o parto, para realização das mesmas análises bioquímicas. Além disso, as vacas serão monitoradas quanto a possíveis transtornos clínicos, que não aqueles esperados no experimento.
Imediatamente após as coletas, será verificado cálcio ionizado no I-Stat, o restante do sangue será submetido à centrifugação a 1800 x g para obtenção do soro, as quais serão divididas em 2 microtubos de 1,5 mL e congelados a – 80 ºC, para posterior análise dos demais metabólitos.
As análises bioquímicas de Cat serão realizadas no Laboratório de Metabolismo do Núcleo de Pesquisa, Ensino e Extensão em Pecuária da Faculdade de Veterinária da UFPel, utilizando kits comerciais (Labtest Diagnóstica S.A., Brasil), por colorimetria, sendo as análises realizadas no aparelho bioquímico automático (Lambax Plenno - Labtest Diagnóstica S.A., Brasil).
A análise estatística será realizada usando SAS Studio (SAS ® Institute Inc., Cary, NC, EUA, 2009). Todas as concentrações sanguíneas serão realizadas por análise de variância (ANOVA) com o procedimento MIXED, para avaliar o efeito de grupo e tempo (horas) e suas interações.
A partir dos resultados obtidos no experimento, será desenvolvido um dispositivo intravaginal de liberação controlada e sustentada, formando uma matriz polimérica biodegradável.
No primeiro teste in vivo do dispositivo, serão utilizados animais, sem raça definida, sendo que receberam a aplicação intravaginal do dispositivo desenvolvido e com a formulação controle sem o princípio ativo.
Serão realizadas coletas de sangue antes da aplicação (hora 0), 30 minutos após a aplicação e de hora em hora até 10 horas após a aplicação (horas 1-10) através da punção do complexo arterio-coccigeo, utilizando o sistema Vacutainer (BD Diagnostics, São Paulo, Brasil) em tubos com ativador de coágulo (10mL), para posterior obtenção do soro para análise de Cat. Em um animal do grupo que recebera o dispositivo com o princípio ativo, será feita a coleta em tubo heparinizado para obtenção dos níveis de Cai, antes da aplicação (hora 0), 30 minutos e de hora em hora até 10 horas após a aplicação (horas 1-10).
Além disso, durante os três dias posteriores, serão realizadas observações diárias no trato reprodutivo do animal para observação de possíveis efeitos colaterais.
As análises estatísticas serão realizadas no pacote estatístico SAS Studio (SAS® Institute Inc., Cary, NC, EUA, 2012). As concentrações sanguíneas de Cat e Cai serão submetidos à análise de medidas repetidas ao longo do tempo, no modelo PROC MIXED, levando em consideração grupo, hora e sua interação, sendo considerada diferença estatística significativa valores com p< 0,05.

Indicadores, Metas e Resultados

Na fronteira científica, o trabalho visa um melhor entendimento de como ocorrem as alterações metabólicas durante a hipocalcemia e os mecanismos homeostáticos envolvidos, identificando, especificamente, os processos que agem no seu controle e como eles interagem frente aos desafios impostos em momentos críticos de liberação de paratormônio e a homeostase do cálcio.
Quanto aos impactos causados por este estudo, no quesito tecnológico, espera-se contribuir positivamente com a comunidade em geral, através da transferência de tecnologias e do depósito de patentes que auxiliem o prosseguimento do conhecimento nesta linha de pesquisa, além da contribuição com novas linhas que venham a surgir.
Já com relação ao impacto científico o projeto visa determinar a maneira com o qual se pode auxiliar o pré e pós-parto de vacas leiteiras, momentos estes de entrave para o produtor obter sucesso em sua atividade, maximizando o sistema produtivo com alternativas rentáveis, sustentáveis e de fácil aplicabilidade, demonstrando assim também, preocupação com os impactos sociais.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
EDUARDO SCHMITT1
JOSIANE DE OLIVEIRA FEIJÓ
MARCIO NUNES CORREA2
RUBENS ALVES PEREIRA
URIEL SECCO LONDERO

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