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Um dos grandes desafios das próximas gerações de estudantes, pesquisadores, assim como agricultores é aumentar a produção de alimentos, tendo em vista a possibilidade de escassez do mesmo frente ao crescimento populacional. O fato de que a população mundial continuará crescendo até aproximadamente 2050, nos remete a expandir conhecimentos acerca do aumento da produtividade e alta eficiência das culturas (FAO, 2013).
Considerado um dos cereais mais importantes do mundo, o arroz (Oryza sativa L.) é cultivado e consumido em todos os continentes, ocupando posição de destaque do ponto de vista social e econômico. De acordo com dados do Instituto Rio Grandense do Arroz (IRGA, 2016), a produtividade média de arroz irrigado no Estado do Rio Grande do Sul (RS) é de 8,1 milhões de toneladas sendo, assim, responsável por 69,51% da produção deste cereal no Brasil. Apesar dos bons níveis de produtividade do arroz irrigado, o arroz de sequeiro ocupa a maior área plantada, correspondendo a 55% do espaço total cultivado, porém, sua produção corresponde apenas a 25% do total brasileiro, enquanto que nos 45% da área total de várzea cultivada são obtidos mais de 70% da produção nacional (SERRAJ et al., 2011).
Em condições de déficit hídrico, grandes mudanças fisiológicas e moleculares ocorrem, resultando na diminuição da produtividade, principalmente durante a fase reprodutiva. Dessa forma, rapidamente é desencadeada uma sequência de reações como a redução na abertura dos estômatos, diminuição da absorção de CO2, menor taxa fotossintética, reflexos negativos sobre o vigor e a altura da planta, diminuição da fertilidade do grão de pólen e, consequentemente, a redução da produtividade (BOTA et al., 2004).
Todavia, os efeitos da restrição hídrica podem variar dependendo de muitos fatores, tais como a intensidade e a duração da falta de água, o genótipo da planta ou fase de crescimento, e a ocorrência de eventos prévios de déficit hídrico que podem deixar um efeito residual (imprint), influenciando o desempenho futuro da planta quando submetida a condições similares (FLETA-SORIANO; MUNNÉ- BOSCH, 2016). O Imprint ou memória de estresse é definida como modificações estruturais, genéticas e bioquímicas que ocorrem como consequência da exposição anterior ao fator de estresse, tornando as plantas, em geral, mais resistentes para as futuras exposições (BRUCE et al., 2007; THELIER AND LÜTTGE, 2012; AULER et al., 2017).
Além disso, de acordo com o conceito dinâmico de estresse, o organismo sob condições adversas atravessa uma sucessão de fases características: alarme, resistência e recuperação. A fase de alarme é definida como o início do distúrbio, onde começam a ocorrer alterações na planta com uma intensificação na rede de sinalização, promovendo a ativação das funções de proteção e de resposta. Essa situação leva a uma fase de resistência, na qual, sob estresse contínuo, a tendência é que a tolerância da planta aumente e a fase de recuperação é quando ocorre uma aclimatação do vegetal frente à condição em que o mesmo está submetido, porém não ocorre com todas as plantas (LARCHER, 2004).
O metaboloma de folhas pode conter até 5.000 metabólitos diferentes (BINO et al., 2004). Considerando os papéis dos metabólitos estabelecidos nas funções das células-guarda, iniciamos o auge da genômica funcional, fluxômica e biologia de sistemas para a compreensão desse sistema altamente sofisticado de modelo de célula única. A identificação de metabólitos críticos adicionais subjacentes ou correlacionados com as respostas ao déficit hídrico formará uma base sólida para um entendimento mais amplo de adaptação das plantas às mudanças ambientais.
Dessa forma, estudar a influência do déficit hídrico no metaboloma de plantas submetidas a eventos recorrentes de estresse irá determinar se o priming é capaz de alterar estas vias em diferentes genótipos e identificar pontos chaves de regulação para maior tolerância a estresses abióticos.
Assim, diante da importância social e econômica da cultura do arroz em nível mundial e para o Brasil, e sabendo-se que, muitas vezes as safras são prejudicadas por estresses como déficit hídrico no solo, a obtenção de informações sobre os mecanismos de tolerância são de extrema importância para auxiliar os programas de melhoramento genético na busca de cultivares que apresentem produtividade estável nestas condições ambientais e, assim, contribuir para a segurança alimentar atual e futura, assim como na busca do uso eficiente da água. Para isso, acredita-se que, alguns desses mecanismos de tolerância possam ser identificados por meio da análise metabolomica, relacionando com demais dados já advindos desse estudo (parâmetros fisiológicos, bioquímicos e proteômicos).
Dessa forma, a hipótese deste trabalho é que genótipos costumeiramente cultivados em diferentes sistemas de cultivo (irrigação e sequeiro) se comportam de maneira divergente frente ao déficit hídrico a nível metabolômico, tanto no momento estressante como nas suas capacidades de recuperar após a limitação hídrica. Acreditamos também que alterações no perfil metabólico irão ocorrer em folhas, devido ao priming, sinalizando para diferentes dinâmicas de resposta nestes genótipos nas condições de déficit hídrico, podendo, desta forma, distinguir moléculas que caracterizam para melhorar o nível de tolerância das plantas estudadas, e com isso lançar futuras investigações diretas a (às) moléculas em questão.

Estresse por Déficit Hídrico
No presente estudo serão utilizados dois genótipos: BRS Querência (subespécie indica), o qual é preferencialmente manejado em solos de várzea e sob sistema de irrigação do tipo inundado e o genótipo AN Cambará (subespécie indica), cultivado em solos de terras altas principalmente sob sistema de irrigação do tipo aspersão, onde se tem menor disponibilidade hídrica.
As sementes dos dois genótipos serão germinadas em rolo de papel em câmara de crescimento do tipo BOD, com fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuro e temperatura de 25±2°C, sendo assim mantidas por sete dias. Após esse período, as plântulas serão transferidas para vasos plásticos com capacidade de oito litros, sendo utilizado como substrato solo coletado do campo e corrigido conforme as recomendações da cultura. As plantas serão mantidas em casa de vegetação com irrigação diária até o estádio V5, a partir do qual serão irrigadas conforme tratamento.
O estresse será aplicado no estádio vegetativo e no estádio reprodutivo no período que antecede a floração, pois ambos os períodos são os mais críticos para a falta de água. Os tratamentos serão da seguinte maneira, conforme abaixo:
C: plantas mantidas na capacidade de campo durante todo o experimento (controle); PTv+R: Pré-tratamento em V5 and estresse recorrente em R1– R2; PTv: Pré-tratamento no estádio vegetativo (V5) sem estresse recorrente em (R1–R2); NPT: sem pré-tratamento em V5 e estresse hídrico em R1–R2. Após a primeira coleta, todos os tratamentos foram irrigados novamente e nova coleta foi feita 24h depois. V5 estádio fenológico com 5 folhas completamente expandidas; R1–R2 início do estádio reprodutivo.

Serão utilizados cinco vasos/tratamento, com quatro plântulas/vasos. Quando as plantas atingirem os períodos determinados para o déficit hídrico, será realizada a suspensão da irrigação nos vasos pertencentes aos tratamentos correspondentes enquanto que nos demais será realizada irrigação apenas com água, mantendo-os na capacidade de campo campo (+- 40% de umidade no TDR). Os vasos, que estarão em capacidade de campo, serão colocados sobre bandejas plásticas para garantir o nível de água. A partir do momento determinado para que a irrigação seja suspensa nos vasos PTv+R e PTv, no estádio vegetativo, e PTv+R e NPT no reprodutivo, a umidade do solo será controlada, com o equipamento TDR EC (Decagon Devices®), até atingir 10% e durante todo o período de suspensão. Após os sete dias, as plantas que estavam sob déficit hídrico serão rehidratadas.
As coletas serão realizadas no estádio reprodutivo no sétimo dia de estresse das plantas, assim como os tratamentos na capacidade de campo. A coleta será realizada de um pool foliar, de folhas (não bandeira) das 3 unidades experimentais e de diferentes porções foliares. Para verificar a capacidade das plantas em se recuperarem, uma nova coleta será realizada após 24h de rehidratação.
O experimento será conduzido em delineamento inteiramente ao acaso, com cinco repetições por tratamento em um esquema fatorial duplo sendo dois genótipos (BRS Querência e AN Cambará) x quatro combinações de momentos de seca (C, PTv+R, PTv e NPT). Ao total o experimento será composto por 40 baldes.
Os tratamentos PTv+R e PTv servirão para comparar os efeitos de memória oriundos do estresse por seca no período vegetativo, somados (PTv+R) ou não (PTv) ao estresse recebido no período reprodutivo. O tratamento NPT servirá para entender os danos do déficit hídrico quando aplicado apenas no período reprodutivo, enquanto o C permanecerá durante todo o ciclo na capacidade de campo, sendo considerado o controle.

Extração de metabólitos
Os compostos serão extraídos a partir de 200mg de tecido foliar liofilizado que após ser triturado, será acrescentado 1mL de uma solução de metanol 80% seguido de agitação em vórtex por 60 segundos. A mistura será centrifugada durante 15 min a 15.000 rpm, 4 °C e o sobrenadante reservado. O resíduo será re-extraído novamente com 1 mL solução de extração e centrifugado novamente. Os sobrenadantes serão reunidos e filtrados através de membrana de nylon 0,45 μm (AllCrom, St. Louis, Mo, EUA. As amostras serão preparadas em triplicata e cada replicata será injetada duas vezes. Extratos serão dissolvidos em 100 mL de ddH2O e aliquotados para GC-MS.

Perfil metabolômico direcionado por GC-EIMS
A fase polar será derivatizada usando cloridrato de metoxiamina (28 μL) por 2 h a 37oC e N-Metil-N- (trimetilsilil) trifluoroacetamida (48 μL, MSTFA) por 30 min a 37oC. As amostras serão analisadas usando cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-EIMS 6850 / 5975B Agilent Technologies) com uma coluna capilar VF-5MS (Agilent, comprimento 30 m, ID 250 μm, espessura de filme de 0,25 μm) e uma pré-coluna (0,25 mm x 10 m). O volume de injeção será de 1 μL usando Hélio como fase móvel (1,0 mL min-1). A temperatura será programada como isotérmica por 5 min a 70ºC, seguida de uma rampa de 5ºC por min até 295ºC. As temperaturas do injetor, da fonte de íons e do quadrupolo serão 230ºC, 200ºC e 150ºC, respectivamente. A análise EIMS empregará uma voltagem de ionização de 70 eV; a faixa de massa registrada foi de m / z 50 a m / z 600 a 2 varreduras / s. As substâncias serão identificadas e comparadas com padrões autênticos e usando espectros de biblioteca digital NIST (v2.0, 2008). (Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia). O Índice Linear de Retenção foi calculado para cada composto usando o padrão de alcano de acordo com (Viegas e Bassoli, 2007).

Perfil metabolômico direcionado por HPLC – DAD:
Os compostos fenólicos serão extraídos de folhas liofilizadas (100 mg) usando 5 mL de metanol a 80% (MeOH), e o volume final do extrato será ajustado para 10 mL. O extrato será filtrado (0,45 µm) e analisado por Cromatografia Líquida de Alto Desempenho acoplada a um detector de matriz de diodos (HPLC-DAD), Agilent 1260 Analytic com coluna Zorbax Eclipse Plus C18 (4,6 x 150 mm, 3,5 μm) a 45 ° C. A fase móvel terá fluxo constante de 1 mL min-1 e gradiente de eluição de ácido acético 0,1% (A) e acetonitrila (B), partindo de 90% (A) por 6 min, diminuindo para 85% (A) por no próximo 1 min e mantendo por 15 min, diminuindo para 50% (A) por 10 min, e diminuindo para 0% (A) pelos próximos 10 min, mantendo-se isocrático pelos últimos 8 min (tempo total de execução 50 min). Um pós-corrida de 5 minutos será aplicado para retornar às condições iniciais de acordo com a versão modificada do método descrito por (Padilha et al., 2017). Os compostos fenólicos serão detectados a 280 e 352 nm. Os conteúdos de cada composto será estimados usando uma curva padrão feita com apigenina (1,5 a 150 μg / mL; y = 17056x e R2 = 0,9963).

Identificação dos metabólitos:
A identificação dos metabolitos será realizada utilizando as bibliotecas espectrais MSRI do banco de dados Golm Metabolome disponíveis no Instituto Max-Planck de Fisiologia Vegetal, Golm, Alemanha (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/gmd/gmd.html)45, Automated Mass Spectral Sistema de Deconvolução e Identificação (AMDIS, Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia, EUA) e Biblioteca de Referência Espectral de Massa do NIST (NIST11 / 2011; Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia, EUA).

Análise de agrupamento e enriquecimento de rotas (Realizada no exterior)
Enriquecimento, super-representação e mapeamento das rotas serão realizados usando funcionalidades disponíveis em ferramentas como MBRole (http://csbg.cnb.csic.es/mbrole/), MSEA (http://www.msea.ca/MSEA/) e MetPA (http://metpa.metabolomics.ca/MetPA/). A análise de agrupamento hierárquico (HCA) usando clustering de ligação média será realizada em distâncias euclidianas usando PermutMatrix51.

Metas
0 -12 meses:
• Aquisição do material de trabalho, estabelecimento dos experimentos e coleta do material;
13 – 24 meses:
• Extração e identificação dos perfis metabólicos direcionados por GC-EIMS e HPLC – DAD em folhas de dois genótipos de arroz submetidos a déficit hídrico recorrente e após sua recuperação;
• Análise dos resultados obtidos;
• Estudo de agrupamento e enriquecimento de rotas metabólicas associadas à tolerância a seca, com auxílio da bioinformática;
• Redação de artigos científicos;


Espera-se, a partir da execução deste projeto e com os resultados obtidos:
• Implantação de metodologias eficientes para a identificação de metabólitos envolvidos na tolerância ao estresse hídrico em plantas de arroz;
• Aprofundar os conhecimentos nas respostas de memória do estresse em diferentes escalas (fisiológicas, bioquímicas, epigenéticas e metabólicas) em plantas de arroz, seguindo a proposta de estudo pioneira no Brasil;
• Contribuir para o conhecimento da fisiologia do estresse hídrico em eventos de estresse recorrente;
• Identificação de metabólitos que possam ser utilizados como marcadores para a seleção assistida de genótipos de arroz tolerantes à seca envolvidos na redução da perda de água pela elucidação das respostas da dinâmica estomática em eventos de estresse recorrente, auxiliando no complexo trabalho de melhoramento e lançamento de cultivares locais tolerantes a estas condições;
• Contribuição para o entendimento de mecanismos adaptativos envolvidos na memória do estresse, através da identificação de rotas metabólicas, associados ao controle das vias relacionadas no estresse estudado em plantas de arroz;
• Disponibilização de informações metabolômicas em portal on line, especificamente de genótipos brasileiros, o que possibilitará que os pesquisadores possam ter acesso a metabólitos próprios do germoplasma de arroz nacional. Este fato é de extrema importância, pois, até o presente momento, todos os dados disponíveis são oriundos de dois genótipos estrangeiros (Nipponbare e 9311), os quais podem ser bastante diferentes dos genótipos utilizados nos programas de melhoramento de arroz do Brasil;
• Formação e capacitação de recursos humanos através da elaboração de relatórios de iniciação científica, dissertações de mestrado ou teses de doutorado, de alunos dos Programas de Pós-Graduação envolvidos nesta proposta de trabalho;
• Fortalecimento de parcerias já estabelecidas entre os Programas de Pós-Graduação em Fisiologia Vegetal e EMBRAPA CLIMA TEMPERADO;
• Disponibilização das informações obtidas para a comunidade científica, por meio da divulgação dos resultados em congressos, seminários e em importantes eventos técnico-científicos, bem como a publicação dos resultados em periódicos de renomado conceito.