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A coturnicultura tem apresentado desenvolvimento bastante acentuado nos últimos anos, adequando-se às novas tecnologias de produção, em que a atividade anteriormente tida como de subsistência, passou a ocupar um cenário de sistema de produção altamente tecnificado, com resultados promissores aos investidores (Pastore; Oliveira e Muniz, 2012).
O efetivo de codornas no Brasil, independentemente da finalidade da criação (produção de carne ou ovos), alcançou a marca recorde de 15,1 milhões de cabeças em 2016, sendo estas aves produzidas em 876 municípios brasileiros (IBGE, 2017). Entretanto, o constante aumento da indústria avícola ocasiona o maior adensamento de animais e a consequente elevação na produção de dejetos, gerando grande preocupação devido à excreção excessiva de elementos como nitrogênio, fósforo e microminerais no meio ambiente. Normalmente, a suplementação de microminerais em dietas para aves é feita com uma ampla margem de segurança, o que acarreta desperdício e aumento do custo de produção (Fernandes, 2012). Isso ocorre, na maioria das vezes, pelo desconhecimento do nutricionista quanto a real exigência das aves, sendo que esses excessos na suplementação geram maiores volumes de fezes produzidas, principalmente em áreas de maior concentração animal, podendo causar impacto ambiental (Gomes et al, 2009). Por isso, são necessárias constantes pesquisas, pois assim como a genética, a nutrição também deve avançar e se adequar às exigências de mercado e ambientais.
A essencialidade do cobre para aves e demais animais já está bem documentada (Davis & Mertz, 1987). O cobre (Cu) é um elemento traço metálico de transição, de caráter básico, essencial para todas as formas de vida e fundamental em diversas funções biológicas (Ortolani, 2002). Este micromineral desempenha papel vital na fisiologia animal, sendo importante para o crescimento e desenvolvimento fetal, para a síntese de hemoglobina, participação em processos inflamatórios, maturação tecidual, especialmente no sistema cardiovascular e desenvolvimento dos ossos e das funções nervosas. O Cu possui uma distribuição celular uniforme e é componente estrutural importante ou cofator de diferentes enzimas em várias vias bioquímicas tanto em plantas como em animais. Os organismos possuem uma capacidade homeostática que lhes permite regular a concentração interna de elementos essenciais e mantê-los a níveis ótimos. No entanto, a capacidade para essa regulação é limitada e quando a concentração externa atinge um nível muito baixo ou muito alto, toxicidade ou deficiência podem ocorrer (Moghaddam & Jahanian, 2009).
O Cu é absorvido principalmente no duodeno. Sua absorção é difícil de medir e os resultados até então publicados são altamente variáveis. A taxa de absorção do Cu pode ser influenciada pelo estado fisiológico do animal, pela forma química do elemento, nível dietético e interações com fitato, ácido ascórbico, fibra e taninos (Jenkins & Hidiroglou, 1989; González & Silva, 2006).
O principal órgão de armazenamento de Cu é o fígado, com cerca de 50% presente no citosol, 20% no núcleo e o restante em demais organelas (Ortolani, 2002). O Cu é transportado do fígado para os demais órgãos periféricos pela ceruloplasmina, uma α-globulina plasmática com uma porção oligossacarídica que une Cu em ambas as formas de oxidação (Cu+ e Cu2+), atuando como armazenadora e transportadora para manter a homeostase deste elemento. A determinação de ceruloplasmina plasmática ou da enzima superóxido dismutase das hemácias, que possuem uma alta correlação com os níveis de Cu sanguíneos, vem a ser um dos métodos utilizados para detectar os níveis hematológicos deste mineral nos animais (González & Silva, 2006). Sua secreção ocorre principalmente junto à bile e é eliminado através das excretas. A excreção de Cu através dos rins é quantitativamente insignificante.
O Cu proveniente dos alimentos apresenta pequena disponibilidade, ao redor de 4%, sendo esta relacionada à forma química em que ele se encontra e a solubilidade. Assim, em ordem decrescente de disponibilidade, tem-se carbonato (CuCO3), nitrato Cu(NO3)2, sulfato (CuSO4), cloreto (CuCl2), óxido (CuO) e Cu metálico (Ortolani, 2002).
A adição de Cu nas dietas de aves tornou-se uma prática comum por conta da sua atividade como promotor de crescimento em níveis profiláticos na dieta (>250 mg/kg) após o uso de antibióticos ser proibido em muitos países (Pekel et al., 2012). O potencial de promotor de crescimento do Cu é atribuído à sua atividade antimicrobiana, em que a microbiota intestinal é alterada para reduzir a perda de fermentação de nutrientes e suprimir os patógenos intestinais (Højberg et al., 2005). Kim et al. (2011) avaliaram a eficácia potencial de altas doses dietéticas de Cu orgânico (100 ppm, Cu-metionina ou proteinato de cobre) como substitutos aos antibióticos destinados à alimentação de frangos de corte. Os resultados do estudo demonstraram que a suplementação da dieta com ambas as fontes de Cu melhorou o desempenho produtivo de frangos de corte e ocasionou um aumento da população de lactobacilos, enquanto diminuiu a de E. coli no intestino. Kwiecien et al. (2014), por sua vez, não encontraram diferenças nos índices de desempenho de pintos alimentados com dieta suplementada com CuSO4 ou quelato de Cu glicerinado. No entanto, o Cu orgânico afetou positivamente as propriedades biomecânicas do fêmur. Adicionalmente, segundo Scott et al. (1982), o Cu desempenha papel importante na formação óssea, sendo ativador da lisil oxidase, enzima que participa da biossíntese de colágeno e elastina.
No Brasil, o uso da nanotecnologia na indústria da alimentação é ainda limitado. Porém, as conquistas e descobertas na área estão começando a impactar e afetar importantes aspectos que englobam desde a segurança alimentar até a síntese de moléculas de novos produtos alimentícios e ingredientes. A nanotecnologia tem potencial para influenciar muitos setores referentes à produção de alimentos e agricultura, como oferecer sistemas de encapsulamento e entrega que transportam, protegem e entregam nutrientes funcionais distintos em seus sítios ativos específicos (Bromberg, 2010).
Se por um lado as nanotecnologias apresentam potencial para promover melhorias no desempenho industrial, na qualidade nutricional e na eficiência das embalagens dos alimentos, podem também trazer maiores riscos à saúde e ao meio ambiente (Martins, 2008). As principais preocupações referentes à nanotecnologia decorrem da falta de conhecimento no que diz respeito às interações dos materiais em escala nanométrica, a nível molecular ou fisiológico, e os seus efeitos e potenciais impactos sobre a saúde do consumidor e o meio ambiente. Devido à sua maior superfície de contato, podem vir, ao menos em teoria, a apresentar maiores efeitos tóxicos que não estão aparentes nos materiais a granel (Dowling, 2004).

Aves
Será utilizado um total 600 codornas de postura (Coturnix coturnix japonica) com 35 dias de idade e peso médio de 100 g provenientes de uma empresa agropecuária local.
Planejamento estatístico/Delineamento experimental e tratamentos
Em cada um dos experimentos serão utilizados 10 tratamentos, com 10 repetições cada um. As aves serão alojadas em gaiolas metálicas, sendo duas por gaiola. Para variáveis de desempenho, cada gaiola será considerada uma unidade experimental. Já para outras variáveis, cada ave será considerada uma unidade experimental.
Nos dois primeiros experimentos será utilizado um esquema fatorial 3 x 3 + 1 (3 fontes de Cu x 3 níveis de adição de Cu + 1 controle).
O primeiro experimento utilizará níveis de Cu abaixo das exigências das codornas, para verificar se a utilização de nano CuO poderá incrementar a absorção do mineral. Serão utilizados 10 tratamentos, incluindo uma dieta controle negativo (sem a adição de Cu); três dietas contendo níveis crescentes de Cu na forma de sulfato (CuSO4); três dietas contendo níveis crescentes de Cu na forma de óxido de cobre (CuO) de tamanho convencional; e três dietas contendo níveis crescentes de Cu também na forma de óxido de cobre (CuO), porém de tamanho nano (tabela 1).

Tabela 1. Tratamentos do experimento 1.
Tratamentos Níveis de cobre
T1 (controle negativo) Controle – sem cobre
T2 (CuSO4) 0,5 mg/kg
T3 (CuSO4) 1,0 mg/kg
T4 (CuSO4) 2,0 mg/kg
T5 (CuO) 0,5 mg/kg
T6 (CuO) 1,0 mg/kg
T7 (CuO) 2,0 mg/kg
T8 (nano CuO) 0,5 mg/kg
T9 (nano CuO) 1,0 mg/kg
T10 (nano CuO) 2,0 mg/kg

Após a realização do primeiro experimento e se não for verificado efeito prejudicial da inclusão de nano cobre na dieta, será realizado o segundo experimento. Do mesmo modo que no primeiro, serão utilizadas dietas semipurificadas, à base de gelatina e dextrose. Será utilizada uma dieta controle negativo (sem a adição de Cu) e as demais deverão seguir o mesmo modelo apresentado no experimento anterior. Entretanto, serão adicionados níveis de Cu abaixo e acima das exigências das aves (tabela 2). O experimento será realizado de forma semelhante ao primeiro, no mesmo local, ambiente, com o mesmo número de aves e pelo mesmo número de dias.

Tabela 2. Tratamentos do experimento 2.
Tratamentos Níveis de cobre
T1 (controle negativo) Controle – sem cobre
T2 (CuSO4) 200 mg/kg
T3 (CuSO4) 400 mg/kg
T4 (CuSO4) 800 mg/kg
T5 (CuO) 200 mg/kg
T6 (CuO) 400 mg/kg
T7 (CuO) 800 mg/kg
T8 (nano CuO) 200 mg/kg
T9 (nano CuO) 400 mg/kg
T10 (nano CuO) 800 mg/kg

Um terceiro e último experimento está previsto e sua estruturação estará na dependência dos resultados obtidos no estudo anterior. Também serão utilizados 10 tratamentos, em que cinco serão com dietas semipurificadas à base de gelatina e dextrose e os outros cinco serão com dietas práticas à base de milho e farelo de soja. As concentrações de CuSO4, CuO e nano CuO serão determinadas com base nos resultados obtidos no segundo estudo.
Neste experimento será empregado o delineamento inteiramente casualizado, utilizando-se análise de variância e um programa de análise estatística. O modelo estatístico incluirá efeitos do tratamento e do erro. Será verificada a presença de interação entre os fatores. Caso não haja interação, as médias dos tratamentos serão comparadas através de regressão polinomial (dentro dos níveis de cada fonte de Cu) e contrastes ortogonais (para a comparação dos níveis de Cu), de acordo com cada experimento.
Conforme pode ser observado a seguir, o número mínimo de repetições para detectar diferenças significativas com um poder de teste de 0,75 é de 10 repetições em cada grupo (tratamento). Considerando-se que são duas aves por repetição (gaiola), será totalizado um tamanho de amostra de 200 unidades experimentais (aves).


F tests - ANOVA: Fixed effects, special, main effects and interactions
Analysis: A priori: Compute required sample size
Input: Effect size f = 0.40
α err prob = 0.05
Power (1-β err prob) = 0.75
Numerator df = 10
Number of groups = 10
Output: Noncentrality parameter λ = 16.3200000
Critical F = 1.9351992
Denominator df = 92
Total sample size = 102
Actual power = 0.7534885

O número total de aves previsto para este trabalho é de 600 codornas, uma vez que o trabalho se divide em três etapas com 200 aves cada um.
Variáveis medidas
Desempenho zootécnico
Ganho de peso (g): O peso dos animais será registrado no primeiro dia e no último dia do período experimental. A diferença entre ambos será o ganho de peso no período de 28 dias.

Taxa de postura (%): Será calculada pela fórmula P (%)=(OPP*100)/Y, em que P(%) é taxa de postura; OPP é o número total de ovos produzidos nos período; e Y é o número de dias do período. Para obtenção desse dado, a produção diária será anotada em planilhas.

Consumo de ração (g): o consumo de ração pelos animais será anotado diariamente em planilhas. Com os dados diários, será feita a média do período.

Conversão alimentar por dúzia de ovo - CDO (kg/dz): Significa quanto de ração o lote consumiu para produzir uma dúzia de ovos dentro do período de 28 dias. Esta variável é determinada pela fórmula: CDO=consumo total de ração (kg)/n° de dúzias.

Qualidade interna e externa dos ovos
Peso médio dos ovos (g): os ovos serão pesados individualmente em balança de precisão, tendo seus pesos anotados em planilhas. Ao final do período ter-se-á o peso médio dos ovos produzidos por cada tratamento.

Unidade Haugh (UH): Após abrir os ovos em placas de Petri será medida a altura do albúmen espesso, com o uso de um paquímetro digital. A UH relaciona a altura do albúmen com o peso do ovo através da fórmula UH=100log⁡ (h+7,57-1,7w^0,37 ), em que h corresponde à altura do albúmen espesso em milímetros e w é o peso do ovo em gramas.

Cor da gema: Com o ovo ainda na placa de Petri será avaliada a coloração da gema através do uso de um leque colorimétrico, que atribui cores em um escore que varia de 1 a 15, em tons de amarelo e alaranjado. Também será feita análise de coloração com o uso do colorímetro digital da marca Konica Minolta®. Serão feitas duas medidas em cada gema e, posteriormente, uma média aritmética com os dois valores. Os parâmetros mensurados pelo colorímetro digital são os do sistema CIEL (Comission International de I’Eclairage): L* (luminosidade), a* (coordenada vermelho/verde) e b* (coordenada amarelo/azul). Com a utilização dos parâmetros a* e b* é possível fazer uma relação e obter o parâmetro C* (croma), que mede a saturação da cor, através da fórmula C*=[(〖a*)〗^2+(b*)^2 ]^(1/2).

Porcentagem e peso de gema (% e g): Após as análises de cor, gema e albúmen serão separados e os albúmens desprezados. As gemas serão pesadas individualmente em balança digital. Com o peso obtido, em gramas, é possível calcular a porcentagem de gema de cada ovo através da fórmula %G=(peso gema/peso ovo)*100.

Porcentagem e peso de albúmen (% e g): O albúmen não será pesado diretamente. Seu peso, em gramas, será obtido através do cálculo de diferença entre o peso total do ovo e os pesos de casca e de gema, através da fórmula Peso alb=peso ovo-peso gema-peso casca. Com o peso, em gramas, é possível calcular a porcentagem de albúmen de cada ovo usando-se a fórmula %alb=(peso alb/peso ovo)*100.

Gravidade específica: Todos os ovos serão colocados em baldes com soluções salinas, de menor para maior concentração de cloreto de sódio (NaCl), variando de 1,066 a 1,102, com intervalo de 0,004, totalizando 10 soluções. Os ovos serão retirados ao flutuarem, anotando-se, assim, o valor respectivo de densidade correspondente à solução do recipiente.

Porcentagem de casca (%): Após serem realizadas todas as análises nos ovos, as cascas serão lavadas com água corrente e secas em temperatura ambiente por 72 horas. Após a secagem serão pesadas individualmente em balança digital.

Espessura de casca (μm): Após serem pesadas, será retirado um fragmento de casca, de três regiões do ovo (basal, apical e medial). Cada fragmento será medido com o uso de um micrômetro digital. Para obter o valor final de espessura da casca é feita uma média aritmética com os três valores obtidos.

Morfometria e histologia
Para estas análises serão utilizados o intestino delgado e o fígado das aves eutanasiadas após o final de cada ciclo. Os órgãos serão imediatamente pesados e em seguida armazenados em formol 10% para serem levados ao Laboratório de Histologia da Faculdade de Medicina da UFPEL onde serão confeccionadas as lâminas para avaliação histológica, conforme metodologia daquele laboratório.

Características ósseas
Também serão retiradas as duas tíbias de cada ave para análise das características ósseas. As tíbias esquerdas serão utilizada para o teste de resistência à quebra, com o uso do Texturômetro Texture Analyser - TAXT2, avaliando-se além da resistência, a rigidez e a flexibilidade das tíbias. Esse teste será realizado no Laboratório de Pós-Colheita, Industrialização e Qualidade de Grãos, do Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial (DCTA) - FAEM, da UFPEL. As tíbias direitas serão levadas ao Laboratório de Nutrição Animal (LNA) da UFPEL para análise de cinzas.

Análises hematológicas
No momento da eutanásia será coletado sangue para realização do exame de hematócrito e dosagem de hemoglobina. Essas análises serão realizadas em laboratório de análises clínicas.

Análise da presença de cobre
Será pesquisada a presença de Cu nas dietas, nos ovos, nas tíbias, no fígado, na bile, no sangue e no plasma. Estas análises serão realizadas no Laboratório de Química Industrial da UFPEL, com a utilização de um espectrofotômetro de absorção/emissão atômica em chama.

O projeto pretende contribuir na produção de conhecimento que auxilie na formulação de dietas para codornas de postura utilizando menores concentrações do mineral cobre, resultando em aumento no desempenho produtivo associado à diminuição de custos de produção e da excreção do mesmo através das excretas.
Com o aumento da preocupação com a poluição e sustentabilidade ambiental, o estudo almeja, de igual forma, encontrar fontes alternativas através da nanotecnologia para melhorar a disponibilidade biológica de minerais e servir como subsídio para implementação de futuros programas nutricionais que possam utilizar esta nova fonte mineral nas dietas de codornas de postura, tanto em nível nacional como internacional.

Metas
• Melhorar o desempenho produtivo, características hematológicas e a microbiota de codornas de postura;
• Melhorar a mineralização óssea de aves;
• Melhorar a utilização e/ou aumentar a retenção de Cu;
• Obter um suplemento nutricional de Cu com maior biodisponibilidade do que o convencional, reduzindo o seu impacto no meio ambiente;
• Assegurar a saúde e a segurança da carne e de ovos de codornas consumidos pela população humana;
• Gerar resumos para publicação em congressos, simpósios e seminários da área;
• Gerar uma tese de doutorado e dois artigos científicos para publicação em revistas de qualis A1 a B1.

Espera-se poder levar para o meio acadêmico-científico, através de resumos, artigos, palestras, seminários e aulas, informações relevantes para a formação e preparação dos profissionais das áreas de Agronomia, Biotecnologia, Medicina Veterinária e Zootecnia, às novas exigências do mercado nacional e internacional com relação à nutrição e produção animal.
No final do primeiro ano de execução do projeto é esperado que tenha sido realizada a primeira etapa e esteja em andamento a segunda, as quais envolvem a realização dos dois primeiros experimentos e a geração dos primeiros resumos para publicação em simpósios, seminários ou congressos.
Ao final do segundo ano, se espera ter concluído a segunda etapa e esteja em andamento a terceira etapa (terceiro experimento), com a consequente geração dos respectivos resumos para publicação em congressos, simpósios ou seminários. No terceiro ano, se espera ter concluído também o terceiro experimento e que estejam sendo escritos os resumos. Além disso, espera-se realizar a submissão do artigo para revista científica internacional qualis A1 ou A2.
Ao término do projeto, ao final do terceiro ano, é esperado que ocorra a defesa de uma tese de doutorado gerada a partir do projeto, por volta do mês de dezembro de 2022.