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Nome do Projeto
Mecanismos moleculares envolvidos nos processos de maturação e resistência a estresses
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
10/05/2021 - 31/12/2028
Unidade de Origem
Centro de Desenvolvimento Tecnológico
Coordenador Atual
VANESSA GALLI
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
Os fenilpropanóides são metabólitos secundários produzidos pelas plantas e estão envolvidos em respostas a estresses bióticos e abióticos. Além disso, eles são sintetizados durante o processo de amadurecimento dos frutos. O interesse por estes compostos, especialmente as antocianinas, tem aumentado devido a seus efeitos benéficos à saúde humana. Portanto, o entendimento dos mecanismos envolvidos no acúmulo desses compostos é de extrema importância para o desenvolvimento de plantas com maior resistência/tolerância a estresses bióticos e abióticos e plantas com maior potencial funcional. Neste contexto, o morango se destaca como modelo para estudar os mecanismos envolvidos no acúmulo de antocianinas. Embora as vias de sinalizações envolvidas na síntese destes compostos ainda não estejam elucidadas, existem evidências de que seja dependente do ácido abscísico (ABA), sendo gerada por uma cascata de sinalização envolvendo cálcio (Ca2 +) e proteínas quinases dependentes de Ca2 + (CDPKs). Em Arabidopsis, tem se apontado os fatores de transcrição WRKY (envolvido na resposta a estresses), além da enzima fenilalanina amônia liase (PAL - enzima limitante na rota metabólica de síntese de fenilpropanóides) como possíveis substratos de CDPKs. Estudos prévios realizados pelo nosso grupo de pesquisa mostraram que dentre os genes que codificam para CDPKs em morango, dois (FaCDPK4 e FaCDPK11) são influenciados pelo estresse, por ABA e pelo processo de maturação. No entanto, este resultado precisa ser validado e o efeito sobre o metabolismo de fenilpropanóides determinado. O crosstalk entre ABA, CDPKs e fenilpropanóide também pode ser regulado por mecanismos pós-transcricionais. Neste contexto, os RNAs circulares tem recebido atenção, podendo atuar com esponjas de miRNAs. Este projeto tem como objetivo identificar e caracterizar a expressão de fatores de transcrição WRKY e de circRNAs, miRNAs e alvos de miRNAs durante o amadurecimento de frutos de morango e em resposta a estresses osmóticos e aplicação de ABA; avaliar o efeito do silenciamento transiente dos genes FaCDPK4 e FaCDPK11 na expressão de genes associados ao metabolismo de ABA e fenilpropanóides, bem como de WRKY, além do acúmulo de compostos fenilpropanóides, ácido abscísico (ABA), ácido abscísico glicosil-ester (ABA-GE), ácido faseico (PA) e ácido dehidrofaseico (DPA); e avaliar o efeito da aplicação exógena de circRNAs sintéticos em frutos de morango, no acúmulo de fenilpropanóides e ABA e na expressão de genes relacionados.

Objetivo Geral

Este projeto tem como objetivo identificar e caracterizar a expressão de fatores de transcrição WRKY e de circRNAs, miRNAs e alvos de miRNAs durante o amadurecimento de frutos de morango e em resposta a estresses osmóticos e aplicação de ABA; avaliar o efeito do silenciamento transiente dos genes FaCDPK4 e FaCDPK11 na expressão de genes associados ao metabolismo de ABA e fenilpropanóides, bem como de WRKY, além do acúmulo de compostos fenilpropanóides, ácido abscísico (ABA), ácido abscísico glicosil-ester (ABA-GE), ácido faseico (PA) e ácido dehidrofaseico (DPA); e avaliar o efeito da aplicação exógena de circRNAs sintéticos em frutos de morango, no acúmulo de fenilpropanóides e ABA e na expressão de genes relacionados.

Justificativa

Os mecanismos bioquímicos e moleculares envolvidos nos processos de amadurecimento dos frutos e no acúmulo de compostos de defesa em resposta a estresses, a exemplo dos compostos fenilpropanoides ainda não foram elucidados. Dessa forma, o conhecimento obtido neste estudo poderá vir a ser utilizado para o desenvolvimento de plantas com maior conteúdo de compostos funcionais (biofortificados) e tolerantes/resistentes a estresses osmóticos. Além disso, estratégias para o controle da maturação de frutos também poderão ser desenvolvidas, através da aplicação de um produto baseado em circRNAs, aumentando a qualidade pós-colheita e o tempo de prateleira destes frutos. Esta estratégia também poderá ser adequada para solucionar outros problemas biológicos a exemplo da resistência a estresses. A execução deste projeto também permitirá estimular a formação de recursos humanos (graduação, pós-graduação) de alto nível científico, numa interação de conhecimentos de fisiologia vegetal, biologia molecular e bioinformática. Além de consolidar colaborações interdepartamentais e interinstitucionais.

Metodologia

O detalhamento do projeto se encontra em anexo. De forma geral, envolve: Identificação, predição da localização celular, predição de exons e introns, análise filogenética, expressão gênica in silico e expressão gênica por RT-qPCR de genes WRKY.
A identificação de circRNAs em morango será realizada utilizando o software CirCom, a partir de bancos de dados de mRNAseq de domínio público e obtidos in house, sendo a anotação gênica realizada a partir do Ensembl Plants. Para identificar miRNAs que poderiam estar interagindo com circRNAs será utilizada a ferramenta psRNAtarget. Os circRNAs que se mostrarem regulados devido em condições de estresse ou devido ao processo de maturação, bem como a sequência de miRNA com melhor valor de expectation value para cada um destes circRNAs serão selecionados para avaliação do perfil transcricional por RT-qPCR, juntamente com seus mRNAs alvos.
O silenciamento de genes FaCDPK envolverá as etapas de amplificação dos fragmentos gênicos, clonagem dos fragmentos gênicos no vetor pTRV e agroinfiltração de frutos de morango. Nestes frutos serão realizadas as seguintes análises: conteúdo de antocianinas individuais (pelargonidina, cianidina, cianidina 3-glicosídeo e cianidina rutinosídeo, peonidina, malvidina, deofinidina) e compostos fenólicos individuais (ácidos ferúlico, ρ-cumárico, gálico, cafeico, sináptico, elágico, epicatequina e catequina, quercitina, kaempferol, mirecitina); conteúdo de ABA, DPA e PA; e expressão dos genes relacionados ao metabolismo de ABA, fenilpropanoides, WRKY.
A aplicação exógena de circRNAs em frutos de morango envolverá as seguintes etapas: síntese de circRNAs e aplicação de circRNAs em frutos de morango.
A análise estatística será realizada por meio da análise de variância utilizando teste F e análise de médias utilizando teste de Tukey a 5% de confiança, através do software SAS 9.1.

Indicadores, Metas e Resultados

Ao final do primeiro ano ter identificado os genes WRKY, bem como, circRNAs, miRNAs e alvos de miRNAs em morango.
• Ao final do terceiro ano ter avaliado a expressão de genes WRKY (aproximadamente 10) e de circRNAs, miRNAs e alvos de miRNAs (pelo menos 5 de cada) durante o amadurecimento de frutos de morango e em resposta a estresses osmóticos e aplicação exógena de ABA; ter obtido os vetores e realizado a agroinfiltração de frutos de morango visando o silenciamento de genes FaCDPK4 e FaCDPK11; e ter sintetizado os circRNAs selecionados (pelo menos 1).
• Ao final do quarto ano ter avaliado o efeito do silenciamento dos genes FaCDPK4 e FaCDPK11 e da aplicação exógena de circRNAs nos metabolismos de ABA e fenilpropanóides, bem como na expressão de WRKY (pelo menos 5).
• Participado em, no mínimo, 4 eventos (nacional ou internacional), com apresentação de trabalho conforme a categoria do evento;
• Submetido ao menos 4 artigos científicos em jornal com Qualis igual ou superior a B1;
• Inserido, no mínimo, dois estudantes de graduação e dois estudantes de pós-graduação;
• Cooperado com, no mínimo, uma instituição de pesquisa, com produção científica conjunta.

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