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Animais que possuem deficiência de leptina, carregam uma mutação no gene ob (DREL; MASHTALIR; ILNYTSKA; SHIN et al., 2006), são obesos, tem menor sobrevida, fertilidade prejudicada, são resistentes à insulina, além de outras comorbidades associadas (COLEMAN, 1978). O efeito da deficiência da leptina na infertilidade se dá através do hipotálamo, visto que a diminuição da liberação de gonadotrofinas acaba prejudicando a ovulação (BARASH; CHEUNG; WEIGLE; REN et al., 1996). Camundongos ob/ob possuem uma reserva ovariana reduzida quando comparada com animais normais, desenvolvimento folicular prejudicado, maior apoptose em folículos pré antrais (SERKE; NOWICKI; KOSACKA; SCHRODER et al., 2012), oócitos deformados com camadas celulares irregulares que é observada tanto em folículos antrais como nos pré antrais (SERKE; NOWICKI; KOSACKA; SCHRODER et al., 2012). A fertilidade é restaurada quando feita a suplementação de leptina exógena (BARASH; CHEUNG; WEIGLE; REN et al., 1996), ou feito transplante de tecido adiposo de irmãos magros da mesma ninhada (BARROS; ALMEIDA; MORI; VALERO et al., 2009). Demonstrando assim a importância da leptina para a função ovariana.
A expectativa de vida tem aumentado nos dias atuais (WEST; LYTHGOE; BARBEN; NOBLE et al., 2014). Além disso, mulheres têm optado por adiar a maternidade, e com isso vem a necessidade do prolongamento da vida reprodutiva feminina, de forma saudável (TREFF; KRISHER; TAO; GARNSEY et al., 2016). Em contraponto a longevidade, há uma alta prevalência de obesidade, que agrava a inflamação quando associada ao envelhecimento, comprometendo a capacidade de resposta à insulina (MANCUSO; BOUCHARD, 2019), e contribuindo para um agravamento de doenças pós-menopausa. A obesidade está associada a problemas reprodutivos, acelera gasto da reserva ovariana (WANG; LUO; XU; XU et al., 2014), ocasionando impactos negativos que também são observados em consequência no envelhecimento.
O envelhecimento e a obesidade também levam a um aumento na proporção de células senescentes estão presentes em diferentes tecidos do organismo (LOPEZ-OTIN; BLASCO; PARTRIDGE; SERRANO et al., 2013) (SERKE; NOWICKI; KOSACKA; SCHRODER et al., 2012). Essas células possuem como características a secreção de fatores pró inflamatórios que atraem macrófagos (TCHKONIA; ZHU; VAN DEURSEN; CAMPISI et al., 2013), sendo assim quanto maior a presença de células senescentes, maior a inflamação (LOPEZ-OTIN; BLASCO; PARTRIDGE; SERRANO et al., 2013). Este acúmulo de células senescentes acaba por ser danoso ao organismo e associado ao declínio das funções corporais durante o envelhecimento. No entanto, são limitados os dados, se há presença ou não de células senescentes em órgãos reprodutores femininos. Assim, nosso estudo visa melhor entender o papel da obesidade na regulação do envelhecimento ovariano, visando preservar a fertilidade e prevenir doenças associadas à redução da reserva ovariana.
Desta maneira, o objetivo do presente trabalho será caracterizar a reserva ovariana de folículos primordiais e sua relação com a senescência celular em camundongos obesos.

Animais e desenho experimental
Os dois projetos foram aprovados pelo comitê de Ética em Experimentação animal, experimento 1, número 3715-2014, experimento 2, número 23110.024915/2020-11. Camundongos fêmeas, serão divididos em dois experimentos. No experimento 1 serão dois grupos formados por animais ob/ob (n=5) e animais WT (n=5), que serão eutanasiados aos 12 meses, e coletado tecido ovariano e gordura periovariana desses animais. O experimento 2 será composto por dois grupos (n=6), ambos de animais fêmeas ob/ob divididos em controle e tratamento. O grupo tratamento receberá senolíticos dasatinib e quercetina (5mg/kg e 50mg/kg respectivamente), dissolvidos no vetor (60% phosal, 30% PEG400 e 10% álcool etílico) durante três dias consecutivos, com intervalo de 14 dias entre uma dose e outra, já os controles irão receber placebo, constituído por apenas o vetor onde serão dissolvidos D+Q (XU et al., 2018). Aos 6 meses de idade os animais do experimento 2 serão eutanasiados para coleta de tecido ovariano e gordura periovariana. Os ovários e a gordura periovariana de ambos experimentos que irão para histologia serão coletados e colocados em formol tamponado 10%, e os que irão para expressão gênica serão armazenados no ultra freezer até o dia das análises. Os animais e seus controles serão mantidos no biotério do laboratório de Nutrição da Universidade Federal de Pelotas, em estantes ventiladas, com água e ração ad libitum, em condições controladas de temperatura (20 ± 2 ºC), umidade (40-70%) e fotoperíodo (12h claro/escuro).
4.2 Teste de tolerância à insulina

Nos animais do experimento 2 aos 6 meses de idade será realizado o teste de tolerância à insulina (TTI) nos animais do grupo tratamento e seus respectivos controles. Após jejum de 2 horas, com água ad libitum, será mensurada a glicemia basal e, posteriormente, administrada insulina humana Novolin R® (5 Ul/Kg de peso vivo) (SREEJAYAN et al., 2008) via intraperitoneal. A glicemia será medida por meio de uma gota de sangue da veia caudal dos animais, nos tempos 0, 5, 20, 35 e 60 minutos após as injeções, com auxílio de glicosímetro comercial Accu-Chek Performa (ROCHE).

Análise histológica
Para ambos experimentos os ovários e a gordura periovariana serão retirados do formol tamponado 10%, desidratados em álcool, clareados em xilol e incluídos em paraplast. Ambas peças emblocadas em paraplast serão sequencialmente cortados no micrótomo semiautomático leica modelo RM2245 (Leica biosystems newcastle Ltda., Newcastle, UK) a uma espessura de 5μm. Alguns cortes de gordura periovariana serão colocados em lâminas histológicas para análises de sudan Black e imunofluorescência. Todo ovário será cortado e utilizado e selecionados 1 a cada 6 cortes e colocados em lâminas histológicas padrão. As lâminas, após secagem na estufa a 56°c por 24 horas, serão coradas com hematoxilina-eosina e montadas com lamínulas e enthelan (Sigma chemical company®, St. Louis, MO, EUA). As imagens dos cortes ovarianos e da gordura periovariana serão capturadas por uma câmera digital Moticam 5.0 (Motic®, Hong Kong, China) acoplada a um microscópio Nikon Eclipse E200 (Nikon corporation, Japan), utilizando objetivas de 4, 10 e 40x. A quantificação dos folículos se dará por aqueles que apresentarem o núcleo dos oócitos claramente visível. A quantidade final de folículos será multiplicada duas vezes, mimetizando a quantidade de folículos dos dois ovários e será multiplicada por seis para contabilizar a amostragem por seção.
Os folículos serão classificados da seguinte forma: folículo primordial aquele em que o oócito é rodeado por uma única camada de células da granulosa achatadas; folículo em transição será classificado como aquele em que ao menos uma célula da granulosa em formato cuboide; folículo primário será classificado como aquele em que um oócito rodeado por uma única camada de células da granulosa em formato cuboides; folículo secundário quando rodeado por mais do que uma camada de células da granulosa cuboides, sem antro visível; folículo terciário se um espaço antral estiver claramente definido e preenchido por líquido folicular e uma camada de células da granulosa em torno do oócito (MYERS; BRITT; WREFORD; EBLING et al., 2004).

Extração de RNA
A extração de RNA total do ovário e gordura periovariana será realizada utilizando protocolo com reagente isotiocianato de guanidina (Trizol, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) associado a um kit de purificação por coluna (Quiagen, Hilden, Alemanha), conforme o protocolo do fabricante. Brevemente, será utilizado Trizol para homogeneizar o tecido usando um homogeneizador de tecidos. Após centrifugação a 12.000 x g por 10 minutos à 4°C, será coletado o sobrenadante descartando os restos celulares e eventual porção gordurosa. As amostras serão incubadas durante 5 minutos a temperatura ambiente a fim de completar a dissociação das nucleoproteínas complexas. Após adição de clorofórmio, o tubo será manualmente agitado por 15 segundos e incubado por 2 a 3 minutos à temperatura ambiente e depois centrifugado a 12.000 x g durante 10 minutos a 4°C. Neste procedimento serão separadas 3 fases. A fase aquosa contendo o RNA será removida e armazenada em um novo tubo livre de ribonucleases. Para a precipitação do RNA, será adicionado isopropanol 100% para cada amostra, as quais serão incubadas a temperatura ambiente durante 5 minutos e transferidos para a coluna. O RNA será então eluido em 20 μL de H2O livre de ribonucleases e sua concentração será aferida utilizando espectrofotômetro (NanoDrop Lite, Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA), em que a pureza das amostras será verificada através da taxa de absorbância 260/280 nm. Todas as amostras serão ajustadas para 200 ng/μL. As amostras obtidas serão guardadas à -80ºC até sua utilização.



Expressão gênica
O DNA complementar (cDNA) será sintetizado a partir de 1 μg de RNA total utilizando kit comercial (iScript cDNA Synthesis Kit, Biorad, Hercules, CA, USA), seguindo as recomendações do fabricante. A PCR em tempo real (RTq-PCR) será conduzida usando GoTaq® qPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, USA) no equipamento StepOne 7500 RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Para cada ensaio serão corridos 45 ciclos (95°C durante 15s e 60 °C durante 60s) e uma curva de dissociação será incluída no final da reação para verificar a amplificação de um único produto de PCR. Os genes β-2-microglobulina (β2m) e β Actina (βAct) serão utilizados como controles endógenos.
Serão analisados os genes relacionados à reserva ovariana: hormônio anti-mulleriano (Amh), genes relacionados à ativação de folículos primordiais: alvo de sinalização mamífero da rapamicina (Mtor), Fator de Transcrição Forkhead Box da classe O3a (Foxo3a), receptor tirosina quinase Kit de células da granulosa e Kit Ligand (Kitl). Genes relacionados a senescência celular: fator de diferenciação de crescimento 15 (Gdf15), inibidor de cinase dependente de ciclina 2A (p16INK4A/CDKN2), Metalopeptidase de matriz 12 (Mmp12), Ligando 2 da quimiocina (Ccl2), Tumor de proteína p53 (TrpP53), interleucina 1 alfa, (IL-1a), Inibidor de quinase dependente de ciclina 1A (P21/cdkn1a), Colágeno tipo I, alfa 1 (Col1a1), Sestrin-2 (Sesn2), stanniocalcina-1 (STC1).

Sudan black

Será realizado o teste de coloração de lipofuscina com o corante sudan Black em lâminas histológicas com cortes de ovário e tecido adiposo periovariano. O protocolo utilizado será ajustado de (URZUA et al., 2018) (EVANGELOU et al., 2017). As lâminas histológicas do tecido ovariano e gordura periovariana serão desparafinizadas com xilol, lavadas em um gradiente de álcool até chegar ao álcool 70% e reidratadas com água. Após diluir o sudan black em álcool 70% evitando a sua precipitação, será utilizada uma seringa de 10ml com filtro disco para gotejar sudan black em uma lâmina comum limpa e a lâmina contendo os cortes foi invertida sobre o sudan black por aproximadamente 2 minutos. Após o procedimento a lâmina com os cortes é separada com auxílio de uma pinça e imediatamente lavada com álcool 50% e água destilada. As lâminas serão montadas com glicerol e em seguida observadas no microscópio de luz nas objetivas de 4, 10 e 40X.
Além disso, será verificada a autofluorescência de lâminas com cortes de ovário e tecido periovariano. Os cortes após serem desparafinizadas com xilol, lavados com álcool e reidratados com água. A montagem das lâminas será feita com glicerol. Em seguida as imagens serão capturadas na objetiva de 4x utilizando um microscópio de fluorescência com câmera acoplada. Será utilizado um filtro com emissão de 510 a 600nm e excitação de 488 a 561 nm. A quantidade de pixels nas imagens será calculada utilizando o software Image J.

Imunofluorescência

Será realizada análise de imunofluorescência para localizar e quantificar macrófagos nos ovários e tecido adiposo peri-ovariano. Para as análises de imunofluorescência, as amostras serão desparafinizadas com xilol, lavadas em um gradiente de álcool e reidratadas com água. Será feito o bloqueio da peroxidase, a recuperação antigênica e o bloqueio das reações inespecíficas. O anticorpo policlonal primário utilizado será anti-CD68 (marcador de infiltração de macrófagos) diluído de acordo com a recomendação. O procedimento de imunofluorescência foi adaptado de acordo com o descrito previamente por nosso grupo (SCHNEIDER; ZHI; MOREIRA; LUCIA et al., 2014). Nos ovários e gordura periovariana, as imagens serão capturadas por um microscópico confocal Olympus FluoView™ 1000 utilizando objetiva de 40X.

Esperamos no modelo de camundongos ob/ob, que são obesos crônicos, com alta inflamação, resistentes à insulina e longevidade reduzida, caracterizar uma reserva ovariana diminuída e a presença aumentada de células senescentes. Também esperamos identificar como a obesidade e seu perfil inflamatório pode prejudicar a reserva ovariana, e se o tratamento com senolíticos pode reduzir o perfil inflamatório e de células senescentes, melhorando a função ovariana.
Como a gordura periovariana em quantidade adequada ou em excesso pode influenciar na qualidade da reserva ovariana esperamos entender como essa pode afetar negativamente a reserva ovariana. Especialmente se essa gordura é capaz de acumular senescência e secretar SASPs em níveis mais elevados que o ovário podendo ter um efeito direto na qualidade oocitária.
Esperamos publicar dois artigos científicos em revista de impacto internacional