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Durante a vida intrauterina, as mulheres desenvolvem seu potencial germinativo e após a puberdade, sob estímulos hormonais passam a recrutar sua reserva finita de folículos (te Velde et al., 1998). Sabe-se que a maioria desses folículos sofrem atresia folicular durante a vida reprodutiva feminina por conta de fatores estressores do meio em que elas estão inseridas, como danos de DNA, espécies reativas ao oxigênio, drogas citotóxicas, ou mesmo, erros metabólicos, como resistência à insulina (Roness et al., 2016; Jeelani et al., 2017). A ciclofosfamida é uma agente alquilante utilizado como imunossupressor e quimioterapêutico (Spears et al., 2019), comumente recomendando em câncer de ovário e mama (Emadi et al., 2009). A aldofosfamida e a 4 hidroxiciclofosfamida são as formas metabolicamente ativas da ciclofosfamida, a instabilidade dessas faz com que dentro da célula haja a conversão em duas moléculas citotóxicas, a fosforamida mostarda e a acroleina, ambas propiciam a apoptose, o que é favorável ao tratamento de câncer (Emadi et al., 2009). A acroleina é considerada o metabólito mais tóxico da droga, pois, além de estimular o aumento de espécies reativas ao oxigênio, reduzir o perfil antioxidante do organismo, favorece danos irreversíveis no DNA (Sun et al., 2015; Jeelani et al., 2017). Em camundongos expostos a ciclofosfamida observa-se uma redução significante da fertilidade dependente da dose administrada, sendo que há uma redução pela metade da reserva ovariana com uma única dosagem de 75mg/kg (Meirow et al., 1999). Os danos são refletidos também nas células granulosas que sofrem apoptose, o que culmina em menor produção do hormônio anti-mullëriano, gerando um estado de maior recrutamento folicular (Chen et al., 2016). Observa-se também, exacerbação da sinalização das vias PI3k, AKT, mTOR durante o tratamento com esse fármaco (Chen et al., 2016; Kalich-Philosoph et al., 2013), vias essas envolvidas com a translocação de proteínas que favorecem o crescimento dos folículos. Em mulheres os relatos demonstram que esse fármaco induz falha ovariana (McDermott e Powell, 1996; Byrne et al., 1992). As atuais técnicas de preservação da fertilidade feminina durante a terapia com ciclofosfamida são muito invasivas e dependem da idade da paciente, do tempo de exposição ao tratamento, assim como da combinação com outros agentes citotóxicos (Bedoschi et al., 2013; Rodriguez et al., 2014). No caso de criopreservação do tecido ovariano, não há garantias contra a reinserção do câncer (Dolmans et al., 2013). Sendo ideal que novas técnicas, menos invasivas e que possam ser aderidas em todas idades das pacientes, sejam pesquisadas com o intuito de solucionar ou mesmo, reduzir os danos à fertilidade ocasionados por esse fármaco.
A metformina é um fármaco da classe biguanidas, utilizado para o tratamento do diabetes (Adak et al., 2018). Tem sido descrita como mimética da restrição calórica (Onken e Driscoll, 2010). Inclusive, observa-se a capacidade da metformina em inibir a via mTOR (Anisimov, 2013) reduzir a resistência à insulina e a expressão de IGF-1(Liu et al., 2011). Vias essas que interagem com a ativação do crescimento folicular (Maidarti et al., 2020). Bem como, demonstrou reduzir a produção de radicais livres de oxigênio endógenos (Martin-Montalvo et al., 2011). Em camundongos submetidos durante seis meses de tratamento com 100 mg/kg/dia com metformina, observou-se maior preservação da reserva folicular ovariana e menor marcação de 4-HNE e p16 (Qin et al., 2019). Além disso, mulheres com Síndrome dos ovários policísticos se favoreceram da administração de metformina, pois há melhora na regularidade dos ciclos menstruais (Sam e Ehrmann, 2017). Ademais, a combinação da metformina com quimioterápicos não reduz a eficácia do tratamento (Kim et al, 2015; Tan et al, 2011).
Fisetina é um flavonoide natural encontrado em diversas frutas e vegetais (Si et al., 2019). É descrita na literatura por seu potencial antioxidante e anti-inflamatório, quimioterápico e quimo-preventivo (Kim et al., 2015; Si et al., 2019). Pode atuar inibindo a via mTOR (Kashyap et al., 2018). Observa-se, ainda, que induz a síntese de glutationa peroxidase (Grynkiewicz et al. 2019) enzima essa, que devido a acroleina é eliminada na urina, diminuindo o perfil antioxidante do organismo (Alarcon, 1976). Ainda são escassos os estudos que utilizam dessa substância para prevenção do envelhecimento ovariano (Lin et al., 2020), nesse mesmo estudo que durou 4 semanas fora administrado a camundongos fêmeas ciclofosfamida com solução salina ou fisetina (100ng/kg/gavagem/1x a cada dois dias)
mais um grupo sem tratamento algum e observou-se que no grupo fisetina houve menor marcação de H2AXp que o grupo PBS, dado que corrobora os achados na reserva ovariana desses animais, que também estava mais preservada e com menor presença de folículos atrésicos. Visto que a maior parte dos estudos com fisetina se detêm em experimentação contra tipos diferentes de câncer, existe a necessidade de mais pesquisas no que tange fertilidade.
O resveratrol, um polifenol natural, apresenta inúmeros benefícios associados a suas propriedades antioxidantes,cardioprotetoras, quimioterápicas (Marchal et al., 2013). O resveratrol é descrito como mimético da restrição calórica e senolítico (Chung et al., 2012). Em um estudo in vitro com células granulosas expostas ao metabólito ativo da ciclofosfamida (4-hidroxiciclofosfamida) o tratamento prévio com resveratrol aumentou a expressão de SIRT1 nessas células, reduziu o estresse oxidativo e declinou níveis de Beclin1, LC3B, Bax e Caspase-3, proteínas envolvidas com apoptose, assim como melhorou a morfologia celular (Nie et al., 2020). Camundongos expostos a ciclofosfamida associada a bussulfan se beneficiaram com uma dosagem de 30mg/kg/dia de resveratrol no que tange tamanho da reserva ovariana, peso e morfologia dos ovários, assim como viu-se nesses animais um aumento da SOD2 (antioxidante), SIRT-1 (antienvelhecimento), e redução de 4-HNE e NTY (marcadores de danos oxidativos e de DNA) (Wu et al., 2019).
Estudos in vitro com a ativação de folículos são difíceis, visto que a remoção do ovário do animal e o cultivo in vitro promove a ativação generalizada dos folículos primordiais, pois se entende que fatores presentes in vivo seguram os folículos primordiais no estágio dormente (Braw-Tal, 2002). Neste estudo, a resposta sistêmica e fisiológica do animal é necessária para melhor analisarmos os efeitos dos tratamentos administrados, por conta disso a essencialidade do modelo proposto.
Visto o potencial benéfico da metformina, fisetina e resveratrol, e a necessidade de novas alternativas de tratamento auxiliar ao quimioterápico com ciclofosfamida contra a exaustão precoce da reserva ovariana, acredita-se que essas substâncias podem apresentar efeitos positivos e serem a base para novos estudos na área. Há escassez de resultados destes fármacos usados de maneira individual sobre a reserva ovariana, especialmente não há nada na literatura sobre a combinação destas terapias. Assim, hipotetizamos que a combinação das três drogas será benéfica e apresentará resultados mais promissores na reserva ovariana que seu uso individual em camundongos induzidos com ciclofosfamida.

Os animais serão fornecidos pelo Biotério da Universidade Federal de Pelotas (UFPel) e mantidos no Laboratório Experimental da Faculdade de Nutrição da UFPel. Serão utilizadas 60 fêmeas da linhagem C57BL/6, mantidas em caixas com as seguintes características: medidas 65x25x15 cm, feita de prolipropileno com tampa em arame galvanizado, com bebedouro em prolipropileno com capacidade de 700 mL, rolha cônica de borracha e bico de aço inoxidável reto. O assoalho será coberto por maravalha. Serão alojadas quatro fêmeas por caixa. O ambiente terá temperatura e umidade controladas em 22-24°C e 40-60%, respectivamente, e ciclo de claro/escuro de 12 horas. Todos os animais receberão ração e água ad-libitum.

Manejo dos animais
Aos 60 dias de idade os animais serão divididos em 6 grupos, sendo dois grupos controle (positivo e negativo), o grupo Ctl (n=10) que não receberá nem ciclofosfamida nem os tratamentos, somente substância placebo via gavagem e i.p, e grupo Ctl-Cyp (n=10) que receberá somente ciclofosfamida (75 mg/kg/i.p) sem os tratamentos, recebendo também substância placebo via gavagem. Os grupos tratamento receberão 7 dias antes da única dose de ciclofosfamida a metformina, fisetina ou resveratrol ou todos mesclados, diariamente via gastrogavagem, e o tratamento será continuado por mais 7 dias após a ciclofosfamida, totalizando 14 dias de intervenção. O grupo Met (n=10) receberá ciclofosfamida (75mg/kg/i.p) + metformina (100mg/kg/gavagem), o grupo Fis (n=10) receberá ciclofosfamida + fisetina (100 mg/kg/gavagem), o grupo Res (n=10) receberá ciclofosfamida + resveratrol (30mg/kg/gavagem). O grupo Comb. (n=10) receberá ciclofosfamida (75mg/kg/i.p) + uma combinação de metformina (100mg/kg/gavagem) + fisetina(100 mg/kg/gavagem) + resveratrol (30mg/kg/gavagem).

Eutanásia
Ao término dos 14 dias, todos os animais serão eutanasiados após jejum de 4 horas, anestesiados por via inalatória com isofluorano, para que após seja realizada a exsanguinação por punção cardíaca, seguida de deslocamento cervical. O procedimento será realizado em sala específica e isolada, localizada anexa ao local onde os animais foram mantidos. Os camundongos serão dissecados e os ovários coletados e estocados: um ovário a – 80ºC e outro em solução de formol a 10% para análises histológicas.

Substâncias utilizadas e dosagens
Ciclofosfamida
Será administrada em uma única dose 75mg/kg via intraperitoneal de ciclofosfamida hidratada (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, USA) aos grupos intervenção e controle Cyp, seguindo o protocolo descrito por (MEIROW et al., 1999) que observou com essa dosagem em camundongos uma redução de aproximadamente 54% da reserva ovariana.

Resveratrol
Conforme protocolo aplicado por (WU et al., 2019), a dose que utilizaremos nos grupos Cyp+Res e Comb., será de 30 mg/kg de trans resveratrol (98%, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, USA), previamente diluído em 0,5% de carboximetilcelulose. O tratamento será diário via gastrogavagem e terá duração de 14 dias.
Metformina
Os grupos Cyp+Met e Comb., receberão diariamente 100 mg/kg via gastrogavagem de cloridrato de metformina (98%, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, USA), diluído previamente em água estéril, conforme o protocolo descrito por (QIN et al., 2019). A terapia com Met terá duração de 14 dias.
Fisetina
Os animais dos grupos Cyp+Fis e Comb., receberão diariamente via gastrogavagem a dosagem de 100mg/kg de fisetina 96% (TCI, America™, Tokio) (LAB), dissolvida previamente em 60% Phosal 50 PG:30%PEG400:10% etanol, conforme o protocolo que observou que essa dosagem em camundongos havia efeito senolítico (YOUSEFZADEH et al., 2018). A terapia com fisetina em nosso estudo também se mantém por 14 dias.
Grupo combinado
Neste grupo será realizada a administração combinada dos compostos propostos para o estudo, sendo administrada ao longo dos 14 dias via gavagem conforme descrição anterior.

Contagem folicular
Remover-se-á os ovários do formal tamponado 10%, submetendo-os a desidratação em álcool, banho em xilol, para após serem incluídos em parafina. Os ovários emblocados em parafina serão cortados sequencialmente a uma espessura de 5μm no micrótomo semi-automático Leica modelo RM2245 (Leica Biosystems Newcastle Ltd, Newcastle Upon Tyne, UK). Serão selecionados 10 cortes por animal, sendo das regiões iniciais, intermediárias e finais do ovário, colocando-os em lâminas histológicas. As lâminas serão submetidas a secagem na estufa a 56°C por 24 horas, após esse período serão coradas por hematoxilina-eosina e montadas com lamínulas e resina sintética (Sigma Chemical Company®, St. Louis, MO, EUA). As imagens dos cortes ovarianos vão ser capturadas por uma câmera digital Moticam 5.0 (Motic®, Hong Kong, China) acoplada ao microscópio Nikon Eclipse E200 (Nikon Corporation, Japan), utilizando as objetivas de 4, 10 e 40X. Essas imagens serão utilizadas para a quantificação folicular.

Expressão gênica
O RNA total das amostras de ovário será extraído usando reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), conforme as recomendações do fabricante. A concentração do RNA será mensurada através de espectrofotômetro (Nanodrop Lite, Thermo Fischer Scientific Inc.®, Waltham, MA, EUA. A razão A260/A280 será utilizada como indicativo de qualidade. Será sintetizado o DNA complementar (cDNA) a partir de 1 μg de RNA total utilizando kit comercial (iScript cDNA Synthesis Kit, Biorad, Hercules, CA, USA), seguindo as recomendações do fabricante. Após, será realizada a PCR em tempo real (RTq-PCR) que será conduzida usando GoTaq® qPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, USA) no equipamento StepOne 7500 RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Para cada ensaio serão realizados 45 ciclos (95°C durante 15s e 60 °C durante 60s) e uma curva de dissociação incluída no final da reação para verificar a amplificação de um único produto de PCR. Os genes β-2-microglobulina (β2M) e β Actina (βACT) vão ser utilizados como controles endógenos.
Os genes a serem avaliados, são os relacionados à reserva ovariana: hormônio anti-mulleriano (Amh), genes relacionados à ativação de folículos primordiais: proteína quinase B (Akt1), fosfoinositídeo-3-quinase (Pi3k), alvo de sinalização mamífero da rapamicina (MMtor), Fator de Transcrição Forkhead Box da classe O3a (Foxo3a), proto-oncogene receptor da tirosina quinase (Kit), ligante do Kit (Kitl) e relacionado com os mecanismos de defesa antioxidante: Sirtuina 1 (Sirt1). Tabela 1 a sequência dos primer’s.

Sudan-black-b (SBB)
SBB é uma técnica descrita por detectar a lipofuscina, um marcador do envelhecimento celular (BRUNK; TERMAN, 2002), embora não considerado marcador absoluto de senescência. O protocolo a ser utilizado foi descrito por (EVANGELOU; GORGOULIS, 2017). Para realizar a colaração SBB nas lâminas histológicas com tecido ovariano, serão desparafinizadas e inseridas em um gradiente decrescente de álcool e reidratadas em água. Depois, será diluído o SBB em álcool etílico 70%, para evitar sua precipitação será utilizada uma seringa de 10 ml com filtro para o gotejamento do SBB em uma lâmina comum limpa e após, a lâmina contendo os cortes será invertida sobre o SBB por aproximadamente 2 minutos.Depois, serão separadas as lâminas e a que contiver os cortes será lavada em álcool etílico 50% e em água destilada. As lâminas serão montadas em glicerol e observadas no microscópio de luz nas objetivas de 4 e 10X. Para avaliar a quantidade de pixels (coloração azul) nas imagens será utilizado o software Image J.

Imunofluorescência
Para as análises de imunofluorescência será necessário que as amostras ovarianas sejam desparafinizadas com xilol e reidratadas em um gradiente de álcool. O protocolo de imunofluorescência será ajustado conforme o descrito por nosso grupo (SACCON et al., 2017; SCHNEIDER et al., 2014). As imagens dos folículos serão capturadas por um microscópico confocal Olympus FluoView™ 1000. Utilizaremos 5 ovários por grupo.
Será utilizado o protocolo descrito anteriormente por nosso grupo (ZANINI et al., 2020). Resumidamente, serão utilizados os anticorpos monoclonais primários que vão ser diluídos em solução de albumina de soro bovino (BSA) a 1,5%. O anticorpo anti-gama H2A.X (fosfo S139) (ab11174; Abcam) será utilizado para indicar danos ao DNA (TITUS et al., 2013), anticorpo anti-p16INK4a (ab5143; Abcam), proteína supressora do crescimento tumoral para indicar senescência celular (CAMPISI, 2013), ambos em uma diluição final de 1: 500. A atividade da peroxidase endógena será bloqueada com peróxido de hidrogênio. A recuperação do antígeno será realizada em câmara de calor úmido em solução de citrato em pH 6,0 por 3 min após o ponto de ebulição. A coloração de fundo não específica vai ser reduzida cobrindo as seções de tecido com BSA e soro de cabra. Em seguida as lâminas serão incubadas com o anticorpo primário em uma câmara úmida a 48C, durante a noite. As lâminas serão incubadas por 1 h a 258°C com Alexa Fluor 488 (ab150113; Abcam) anticorpo secundário, seguido por Hoechst (ab228550; Abcam) por 15 min a 258°C para corar os núcleos. As amostras vão ser cobertas com lamínulas e meio de montagem. As imagens vão ser capturadas utilizando um microscópio confocal (FluoView 1000; Olympus) e a intensidade de fluorescência será quantificada para gH2AX e p16 usando ImageJ (SCHNEIDER et al., 2014).

Espera-se que através dessa pesquisa seja possível contribuir com a descoberta de um potencial método seguro e não invasivo de preservar a fertilidade de modelos animais induzidos a falha ovariana por agente alquilante, ao qual normalmente é utilizado como quimioterápico. Para assim, se favorável, novos estudos se dediquem a explorar os efeitos terapêuticos dos compostos que aqui elucidamos. Visando em um futuro, se completamente validado em modelos experimentais, a aplicação em mulheres. Trazendo assim, a perspectiva de que com essa pesquisa, se desenvolva um tratamento que preserve a fertilidade e previna o envelhecimento ovariano em qualquer faixa etária de mulheres expostas a ciclofosfamida.
Além de, observar a relação entre os compostos e a preservação da fertilidade, o que inclui, menor marcação de danos ao DNA nos folículos e apoptose nas células da granulosa, se espera um efeito protetor contra o envelhecimento ovariano induzido pela ciclofosfamida.
Esperamos publicar dois artigos científicos em revista internacional com base neste projeto.