Nome do Projeto
IMPACTOS DO DÉFICIT HÍDRICO E DA HIPÓXIA EM PARÂMETROS FISIOLÓGICOS, BIOQUÍMICOS E MOLECULARES DE DIFERENTES COMBINAÇÕES PORTA-ENXERTO/COPA DE PESSEGUEIRO
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
02/08/2021 - 31/07/2025
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
O Brasil é o 13º produtor mundial de frutas de caroço, sendo o Rio Grande do Sul (RS) o principal estado produtor, responsável por cerca de 60% da produção nacional. Entretanto, a produtividade média dos pomares gaúchos é a mais baixa do país, fato atribuído a combinação da baixa qualidade genética dos porta-enxertos utilizados e aos estresses bióticos (nematóides, fungos e bactérias patogênicos) e abióticos (déficit hídrico, hipóxia, pH ácido dos solos e baixa fertilidade). Logo, propõe-se estudar os impactos do estresse hídrico (por déficit e alagamento) sobre os parâmetros fisiológicos, bioquímicos e moleculares associados à respiração, metabolismo e transporte de carboidratos/nitrogênio e de aminoácidos osmoprotetores, em diferentes combinações de porta-enxertos e cultivares copa de pessegueiro. Estresse por déficit hídrico e/ou excesso de água no solo são frequentes nos pomares gaúchos, especialmente na metade sul do RS, reduzindo significativamente a produtividade dos pomares. Por isso, existe a urgente necessidade de se avaliar as respostas ao estresse hídrico utilizando plantas selecionadas especificamente para uso como porta-enxertos, pois no Brasil a produção de mudas de frutíferas de caroço são utilizados porta-enxertos obtidos de caroços descartados das indústrias de conserva na sua grande maioria, ou seja, sem identidade genética conhecida. Esse tipo de material vegetal produz porta-enxertos com alta variabilidade genética, suscetíveis a pragas e doenças do solo, afetando negativamente a produtividade das plantas e a qualidade dos frutos. Nosso grupo de pesquisa vem realizando estudos sobre o tema em nível transcriptômico, no entanto, necessita validar as informações obtidas através da correlação de dados moleculares com dados fisiológicos e bioquímicos. Baseado nisso, cinco experimentos serão realizados, visando contribuir para o melhor entendimento dos eventos metabólicos associados ao problema em estudo. O 1º experimento terá por objetivo estudar as respostas de curto prazo relacionadas ao padrão de expressão de genes alvo do metabolismo glicolítico, fermentativo e de parâmetros fisiológicos em plantas do porta-enxerto Tsukuba 1 sob condições de hipóxia. No 2º experimento, será estudado o efeito da hipóxia, em médio prazo, sobre parâmetros fisiológicos, bioquímicos e moleculares de plantas enxertadas e não-enxertadas de pessegueiro. Considerando também que existem evidências da participação de intermediários do ciclo do óxido nítrico na mitigação dos efeitos da hipóxia, o 3º experimento será realizado para avaliar a influência da adubação nitrogenada sobre o metabolismo de carboidratos e aminoácidos em pessegueiro ‘Rubimel’ enxertado sobre ‘Capdeboscq’ sob condições de hipóxia e pós-hipóxia. No 4º e 5º experimentos serão avaliados os impactos do déficit hídrico sobre os parâmetros fisiológicos, trocas gasosas, expressão gênica e metabolismo de carboidratos e aminoácidos osmoprotetores em diferentes porta-enxertos de Prunus spp, enxertados com as cultivares-copa ‘Chimarrita’ e 'Rubimel'. A melhor compreensão das relações entre os dados moleculares, bioquímicos e fisiológicos tem grande potencial para auxiliar não só no manejo da cultura do pessegueiro e ameixeira, mas também na seleção e/ou indicação de genótipos mais tolerantes para condições de déficit hídrico e de hipóxia, visando melhorar a qualidade das frutas e a produtividade dos pomares.

Objetivo Geral

Integrar abordagens fisiológicas, bioquímicas e moleculares, visando o melhor entendimento das repostas fenotípicas e processos celulares impactados pelo déficit hídrico e hipóxia, em diferentes combinações porta-enxerto/copa de plantas de pessegueiro, para auxiliar no processo de identificação de genótipos mais tolerantes a tais estresses.

Justificativa

Em relação a porta-enxertos de Prunus spp., ainda existe uma grande lacuna no que tange o entendimento das vias de respostas de tolerância a situações de privação de oxigênio no sistema radicular e também sobre as respostas ao déficit hídrico de diferentes genótipos. A demanda por soluções relacionadas a determinação do uso de porta-enxertos mais adequados para frutíferas de caroço no Brasil é emergencial. Na última década, os relatos de morte de plantas nos pomares têm sido preocupantes, sendo a hipóxia radicular um dos principais fatores ligados a esta condição. Somado a isso, não há relatos de estudos que envolvam respostas a adubação nitrogenada em plantas compostas por enxerto/porta-enxerto de Prunus e a caracterização das respostas de remobilização de carboidratos e aminoácidos entre raiz/parte aérea.
Sendo assim, a combinação de análises fisiológicas, bioquímicas e moleculares, abrem novas oportunidades para a aplicação de biotecnologias que auxiliem na melhor compreensão dos eventos celulares e fenotípicos que ocorrem em diferentes combinações de porta-enxerto/copa de plantas de Prunus spp. sob condições de estresse hídrico, contribuindo para a identificação e/ou desenvolvimento de novos genótipos melhor adaptados frente a diferentes condições de cultivo.

Metodologia

O projeto englobará a realização de 5 experimentos ao longo de quatro anos.

Experimento 1 - "Padrão de expressão de genes alvo do metabolismo glicolítico, fermentativo e de parâmetros fisiológicos em plantas do porta-enxerto Tsukuba 1 sob hipóxia".
Objetivo: Identificar as respostas fisiológicas e moleculares de curto prazo induzidas pelo estresse por hipóxia em seedlings do porta-enxerto ‘Tsukuba 1’, visando estimar que período de alagamento é crítico para realização de estudos sob tais condições, e guiar estudos futuros.
O material vegetal será composto de plantas do porta-enxerto 'Tsukuba 1' propagados por semente, que serão utilizadas ao atingirem 25 cm de altura, nas quais serão aplicadas as seguintes condições experimentais: i) controle, as plantas mantidas com irrigação diária, até a capacidade de campo, e ii) plantas submetidas a: tempo zero (controle); 1; 2; 4; 8; 16; e 32 horas de alagamento, o qual terá início às 8 horas da manhã. Cada tratamento será composto de quatro repetições biológicas e cada repetição será representada por uma planta. Será analisado a condutância estomatica, e coletado amostras de raízes em cada tempo de alagamento para extração de RNA, para análise de expressão gênica das vias glicolítica e fermentativa.


Experimento 2 - "Efeito da hipóxia sobre parâmetros fisiológicos, bioquímicos e moleculares de plantas enxertadas e não-enxertadas de pessegueiro (Prunus persica L. Batsch)"
Objetivo: Identificar as respostas moleculares, bioquímicas e fisiológicas adaptativas ao estresse por hipoxia na cultivar-copa ‘Rubimel’ enxertada sobre dois porta-enxertos de pessegueiro.
O material vegetal será composto de porta-enxertos, ‘Tsukuba 1’ e ‘Capdeboscq’ e a cultivar copa Rubimel. As plantas (1) ‘Tsukuba 1’ autoenraizado; 2) ‘Capdeboscq’ autoenraizado; 3) ‘Rubimel’ autoenraizado; 4) ‘Rubimel’ enxertado sobre ‘Tsukuba 1’; e 5) ‘Rubimel’ enxertado sobre ‘Capdeboscq’).
Serão testados dois tempos de hipóxia, sendo o primeiro, determinado no experimento 1, no qual serão coletados apenas folhas para análises de expressão de genes alvo, atividade enzimática e determinação de carboidratos. Enquanto que no tempo 72 horas de estresse por hipóxia e nos controles, além de amostras de folhas, serão coletadas amostras de ramos e raízes, para as mesmas determinações. O delineamento experimental será casualizado, em esquema fatorial 5 x 3, sendo cinco classes de mudas e três períodos de coleta (normóxia ou controle; tempo de hipóxia 1, a ser determinado no Experimento 1; e 72 horas de hipóxia). Cada tratamento será composto por 4 repetições, uma planta por repetição.
Além da condutância estomatica e temperatura foliar, será determinado o teor de amido, açúcares solúveis totais e de sacarose, bem com a expressão de genes alvo do metabolismo glicolítico, fermentativo e de carboidratos.

Experimento 3 - "Efeito a enxertia de do aporte diferencial de nitrogênio sobre o metabolismo de carboidratos e aminoácidos em pessegueiro ‘Rubimel’ franco e enxertado sobre ‘Capdeboscq’ sob condições de hipóxia e pós-hipóxia"
Objetivo: Verificar os efeitos da suplementação nitrogenada em plantas de Prunus, com aplicação pré e pós o estresse, avaliando os parâmetros de crescimento, assim como as respostas sob o nível de expressão gênica e atividade enzimática.
Serão produzidas as seguintes combinações de plantas: a) ‘Rubimel’ enxertada em ‘Capdeboscq’ e b) ‘Rubimel’ pé franco.
Para testar a hipótese de que a enxertia e o aporte de Nitrogênio pré e pós alagamento melhora a tolerância das plantas e recuperação, serão utilizados os seguintes tratamentos no período que antecede o período de estresse, em cada combinação de plantas descrita acima (plantas de ‘Rubimel’ enxertadas e não enxertadas):
1ab) sem adição de N + alagamento de120horas + recuperação;
2ab) adição de N + alagamento de 120 horas + recuperação;
3ab) sem adição de N + alagamento de 120 horas + N + recuperação
4ab) plantas controle (receberão N conforme descrito para o tratamento 2ab, sendo mantidas irrigadas na capacidade de vaso);
As plantas do tratamento 2ab receberão adubação nitrogenada (nitrato de amônio – NH4NO3) dividida em duas aplicações anteriores ao alagamento, sendo uma em outubro (6g NH4NO3 por vaso) e outra em dezembro (6g NH4NO3 por vaso) 15 dias antes do início do experimento. As plantas do tratamento 3ab receberam uma dose de N (6g NH4NO3 por vaso), três horas após a retirada das plantas da condição de alagamento.
A submissão do alagamento ocorrerá em um tanque, onde estarão todas as combinações de plantas, sendo que ocorrerá a manutenção de 3cm de água acima do solo. Os controles serão irrigados conforme necessidade até sua capacidade de vaso, sendo estes com adubação nitrogenada.
Serão feitas coletas de material vegetal para análises em três momentos: no dia zero, 120h de alagamento do solo e após 120h de recuperação. Serão realizadas análises de trocas gasosas; monitoramento da concentração de oxigênio na solução do solo diariamente ao longo do período de alagamento e de recuperação, conteúdo relativo de água, potencial osmótico e de pigmentos fotossintetizantes nas folhas. Ao final do experimento serão coletados material para análise química do solo (macro e micronutrientes); análise de macro e micro nutrientes nos tecidos vegetais (folhas e raízes); análise do teor de aminoácidos solúveis totais e de carboidratos em amostras de folhas, raízes e na seiva coletada do floema e xilema; determinação da atividade enzimática e de expressão genes alvo associados ao metabolismo de prolina, glicina-betaína, carboidratos e de nitrogênio em amostras de folhas e raízes.

Experimento 4 - "Impactos do déficit hídrico sobre parâmetros fisiológicos, expressão gênica e metabolismo de carboidratos da cultivar Chimarrita enxertada sobre dois porta-enxertos de pessegueiro".
Objetivo: Caracterizar as respostas fisiológicas e bioquímicas de plantas de pessegueiros cultivar ‘Chimarrita’, enxertadas sobre ‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba-1’, e submetidas ao déficit hídrico.
Serão utilizados pessegueiros da cultivar-copa ‘Chimarrita’ enxertados sobre a cultivar ‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba-1’. O delineamento experimental adotado será inteiramente casualizado, com esquema fatorial 2 x 2 (regimes hídricos x porta-enxertos), com quatro repetições de cada tratamento, cada uma representada por um vaso contendo uma planta. O fator regime hídrico será composto de dois níveis: a) substrato mantido em capacidade de campo; e b) substrato sob déficit hídrico.
A verificação e a manutenção do status hídrico das plantas será realizada diariamente com a utilização do instrumento TDR (Time Domain Reflectometer - Trase System), considerando como capacidade de campo a umidade de 45% medida pelo aparelho (baseado em determinações prévias por pesagem dos vasos). Para o regime de déficit hídrico, a irrigação será suspensa no início do experimento (dia 1), sendo realizado o monitoramento do percentual de umidade com o aparelho TDR diariamente. Quando o teor médio de umidade chegar em 10%, será realizada a reposição da água até se obter teor de umidade do substrato de 15%, e a partir do 12º dia, não será mais realizada reposição hídrica, até o 17º dia (último dia do experimento), sendo monitorado diariamente.
Será avaliado o potencial hídrico de folha, condutância estomática, temperatura foliar. O potencial hídrico da folha será averiguado a cada dois dias, no horário das 12:00 às 14:00 horas. A condutância estomática e temperatura foliar será avaliada diariamente, no horário das 12:00 às 14:00 horas. Ao final do experimento, o material vegetal será coletado para as seguintes as análises: quantificação de clorofila a, b e clorofilas totais, carotenoides, prolina, glicina-betaína e potencial osmótico de folha. Além destas, também será avaliado: taxa de crescimento de ramos, durante e após o período de restrição hídrica; parâmetros associados a trocas gasosas (com uso de IRGA, se disponível); extravasamento de eletrólitos nas folhas, conteúdo relativo de água nas folhas, taxa de abscisão foliar e conteúdo de carboidratos.

Experimento 5 - "Impactos do déficit hídrico e da enxertia sobre parâmetros fisiológicos, bioquímicos e moleculares em plantas de pessegueiro cultivar BRS Rubimel enxertada sobre quatro porta-enxertos de pessegueiro".
Objetivo: Estudar as respostas fisiológicas, bioquímicas e moleculares de plantas de pessegueiros da cultivar-copa ‘BRS Rubimel’ enxertadas sobre diferentes porta-enxertos, sendo eles ‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba-1’, ‘Tsukuba-2’ e ‘Tsukuba-3’, submetidas ao déficit hídrico.
Serão utilizadas plantas de pessegueiro da cultivar-copa ‘BRS Rubimel’ enxertadas sobre quatro porta-enxertos (‘Capdeboscq’, ‘Tsukuba-1’, ‘Tsukuba-2’ e ‘Tsukuba-3’). O delineamento experimental adotado será o inteiramente casualizado, com esquema fatorial 2 x 4 (regime hídrico x porta-enxertos), havendo oito tratamentos, com quatro repetições para os tratamentos submetidos ao déficit hídrico e três repetições para os tratamentos mantidos à capacidade de campo, sendo a unidade experimental representada por em um vaso contendo uma planta, com 27 meses de idade.
O regime hídrico adotado será: a) plantas controle, o substrato será mantido em capacidade de campo; e b) plantas sob restrição hídrica, substrato sob déficit hídrico, conforme descrita na sequência. A verificação do status hídrico será realizada diariamente com a utilização do instrumento TDR, conforme descrito no experimento 4. As variáveis respostas analisadas serão as mesmas descritas no experimento 4, além da determinação do potencial hídrico de folha, a cada dois dias, destacando-se uma folha completamente expandida e saudável, do terço média de cada planta, e submetendo-a a pressão através de Câmara de Scholander, verificando a pressão exercida em Bares, e passando-se o resultado para Megapascal (MPa) dividindo-se o valor em bares por 10. A aferição será realizada entre às 12 e 15 horas.


Indicadores, Metas e Resultados

Meta 1 - Ações serem realizadas no Semestre 2/2021
- Produzir plantas do porta-enxerto ‘Tsukuba 1’, via sementes, para uso no Experimento 1;
- Instalar o Experimento 1 e avaliações fisiológicas e coleta de amostras para as análises moleculares;
- Determinar o melhor gene normalizador e fazer as análises de expressão de genes alvos;
- Propagar clonalmente as cultivares ‘Capdeboscq’, ‘Tsukuba 1’ e ‘Rubimel’ (estaquia, transplantio, enxertia) e realizar o manejo das plantas até a instalação do Experimento 2; obter por sementes porta-enxertos das cultivares 'Capadeboscq', 'Tsukuba 1, 2 e 3' para preparo das plantas para os demais experimentos.
Indicadores: número de plantas produzidas via semente e por propagação clonal; Número de genes normalizadores e de genes alvo testados.
Resultados esperados: conclusão da parte experimental do experimento 1 e obtenção de todas as plantas necessárias para o experimento 2.

Meta 2 - Ações a serem realizadas no Semestre 1/2022
- Preparo do manuscrito para divulgação dos resultados do experimento 1;
- Continuidade da propagação clonal e do manejo das plantas das cultivares ‘Capdeboscq’, e ‘Rubimel’ (estaquia, transplantio, enxertia) para uso no n a instalação do Experimento 2.
Indicadores: Artigo submetido para publicação; numero de plantas propagadas, aclimatadas e enxertadas.
Resultados esperados: Um artigo submetido; obtenção de plantas suficientes para uso no Exp. 2.

Meta 3 - Ações a serem realizadas no Semestre 2/2022
- Cultivar e transferir plantas para vasos, e manejo até uso no Exp. 2.
- Instalar o Experimento 2; realizar as análises fisiológicas; coleta de material vegetal para as análises moleculares e bioquímicas;
- Propagação clonal e manejo das plantas dos porta-enxertos das cultivares 'Capadeboscq', 'Tsukuba 1, 2 e 3' para preparo das plantas para os experimentos 3, 4 e 5.
- Realizar as análises moleculares e bioquímicas do experimento 2.
Indicadores: Número de plantas produzidas por semente e via clonal; número de variáveis fisiológicas, bioquímicas e fisiológicas analisadas;
Resultados esperados: Obtenção de número suficiente de plantas para uso nos experimentos 3, 4 e 5; conclusão da análise estatísticas dos dados fisiológicos; dar início as análises bioquímicas e moleculares do Exp. 2.

Meta 4 - Ações a serem realizadas no Semestre 1/2023
- Instalar o Exp. 3 e realizar as análises fisiológicas, coletas de material vegetal de plantas submetidas ao estresse por hipóxia, com e sem aporte diferencial de nitrogênio;
- Realizar as análises de quantificação relativa dos genes alvos, previamente selecionados;
- Propagar clonalmente e realizar o manejo dos porta-enxertos e enxertia de cultivares copa em porta-enxertos para uso nos Exps. 4 e 5.
- Conclusão das análises bioquímicas e moleculares do Exp. 2.
Indicadores: Número de plantas enxertadas e manejadas; número de análises fisiológicas concluídas e de amostras coletadas para análises bioquímicas e moleculares;
Resultados esperados: Início da redação do manuscrito referente ao Exp. 2, da análise estatística dos dados fisiológicos do Exp. 3; início das análises moleculares e bioquímicas.

Meta 5 - Ações a serem realizadas no Semestre 2/2023
- Conclusão do manuscrito com os resultados do Exp. 2;
- Manutenção e manejo das plantas para uso nos Exps. 4 e 5;
- Determinar o conteúdo de carboidratos e atividade enzimas chaves, assim como, a quantificação relativa de genes associados ao metabolismo de carboidratos em amostras de folhas e raízes de plantas de Prunus (experimento 3);
- Analisar os dados referentes ao experimento 3 e redigir.
Indicadores: número de manuscritos redigidos; número de análises moleculares e bioquímicas concluídas; número de plantas manejadas;
Resultados esperados: Submissão do manuscrito referente ao Exp. 2; conclusão e análise estatísticas dos resultados do Exp. 3; Ter número de plantas suficientes para instalação dos Exps. 4 e 5.

Meta 6 - Ações a serem realizadas no Semestre 1/2024
- Instalar o experimento 4 (déficit hídrico) e realizar as análises fisiológicas;
- Coletar material para análises bioquímicas e moleculares;
- Redigir manuscrito com dados Exp. 3.
- Efetuar o manejo das plantas em casa de vegetação;
- Iniciar análises bioquímicas das amostras do Exp. 4.
- Realizar a propagação clonal in vitro e por estaquia de novos genótipos de Prunus (incluindo ameixeiras) para uso em experimentos futuros, visando dar continuidade aos estudos.
Indicadores: número de amostras de tecido vegetal coletadas; número de análises fisiológicas e bioquímicas realizadas; número de plantas propagadas in vitro ou por estaquia.
Resultados esperados: Conclusão e submissão de manuscrito referente ao Exp. 3; obter plantas propagadas in vitro ou por estaquia de duas e três novas cultivares de porta-enxertos de pessegueiro e ameixeira, respectivamente; ter plantas preparadas para iniciar o experimento 5; Iniciar a redação do manuscrito referente ao Exp. 4.

Meta 7 - Ações a serem realizadas no Semestre 2/2024
- Concluir as análises bioquímicas do experimento 4;
- Instalar o experimento 5 e realizar as análises fisiológicas;
- Efetuar o manejo das plantas em casa de vegetação;
- Conclusão da análise de dados do Exp. 4;
- Redigir o artigo referente ao experimento 4;
- Realizar as análises bioquímicas do experimento 5.
Indicadores: número de plantas analisadas e de amostras coletadas; número de análises fisiológicas e bioquímicas realizadas; número de artigos aceitos para publicação referentes aos Exp. 1, 2 e 3 e submetidos para publicação.
Resultados esperados: Concluir a redação e submissão do manuscrito referente ao Exp. 4; Ter publicados pelo menos os artigos referentes aos Exp. 1 e 2 e ter aceite do do artigo referente ao Exp. 3.

Meta 8 - Ações a serem realizadas no Semestre 1/2025
- Concluir as análises propostas no Exp. 5;
- Analisar os resultados do Exp. 5;
- Continuar as atividades de propagação e manejo de material vegetal para uso em novos experimentos;
- Redigir o artigo referente ao experimento 5 e elaborar o relatório do projeto visando a prorrogação do mesmo, para dar continuidade aos estudos nesta linha de pesquisa;
Indicadores: número de análise fisiológicas, moleculares e bioquímicas realizadas; número de artigos submetidos e aceitos para publicação; número de alunos de Iniciação Científica (IC), Mestrado, Doutorado, Pós-doutorado e estagiários de graduação envolvidos ao longo do projeto; número de resumos simples e expandidos apresentados e publicados em eventos científicos; número de trabalhos de IC, mestrado e doutorado concluídos e em andamento; Recursos financeiros captado em agência de fomento para dar suporte ao longo do projeto.
Resultados esperados: Publicar pelo menos 5 artigos científicos em revistas com fator de impacto igual ou superior a 1 (um); orientar pelo menos 4 alunos de IC, dois alunos de mestrado e um aluno de doutorado. Preparar material vegetal de pessegueiro e ameixeira para dar continuidade ao estudo com novos genótipos e novas condições de estresse visando complementar os estudos para esclarecer eventos e dúvidas resultantes dos experimentos dessa primeira etapa do projeto.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
EUGENIA JACIRA BOLACEL BRAGA2
FLÁVIA LOURENÇO DA SILVA
GABRIELLE LEIVAS DE LEIVAS
GUSTAVO MAIA SOUZA3
Jonatan Egewarth
SIMONE RIBEIRO LUCHO
VALMOR JOAO BIANCHI23
VANESSA ROCHA DA SILVA

Fontes Financiadoras

Sigla / NomeValorAdministrador
CAPES / Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível SuperiorR$ 8.960,00Coordenador

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