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O pato-mergulhão (Mergus octosetaceus) é uma espécie de ave classificada como criticamente em perigo (CR) de extinção (BirdLife International, 2019). Embora seja uma ave nativa das Américas, atualmente só é encontrada no Brasil, com registros na Serra da Canastra – MG, Chapada dos Veadeiros – GO e Jalapão – TO e estima-se que existam menos de 250 indivíduos adultos na natureza, com tendência à diminuição. Destes, a maioria (cerca de 160 indivíduos) encontra-se na Serra da Canastra (Ribeiro et al., 2018). Estas aves habitam rios de águas limpas, rasas e com pequenas corredeiras, sendo que a ação humana (desmatamento, agricultura, turismo) é a principal ameaça à espécie, por ocasionar perturbação do habitat e poluição dos rios. O pato-mergulhão necessita de águas límpidas e transparentes para sua sobrevivência e sua presença é um bioindicador de que o ecossistema está em equilíbrio (Hughes et al., 2006). Pela sua importância na conservação da biodiversidade, foi reconhecido pelo Ministério do Meio Ambiente como símbolo das Águas Brasileiras (D.O.U., 2018) durante o 8º. Fórum Mundial da Água, realizado em Brasília em 2018.
Em 2006 o IBAMA aprovou o primeiro ciclo (2006-2016) do Plano de Ação Nacional (PAN) para a Conservação do Pato-mergulhão (ICMBIO, 2020), onde foi possível aprofundar o conhecimento quanto à biologia da espécie. Em 2011 iniciou-se o Projeto de Reprodução ex-situ do Pato-mergulhão, com o estabelecimento de uma população em cativeiro que conta atualmente com 25 indivíduos adultos e 15 jovens, oriundos de ovos coletados na natureza, mantidos no Zooparque Itatiba-SP (Zooparque, 2021). O segundo ciclo do PAN, sob coordenação do Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio), iniciou em 2018, com término previsto para 2023 (Portaria ICMBio 122, 2018) e tem por objetivo geral incrementar as populações de pato-mergulhão e assegurar a conservação de seu habitat. Entre as estratégias de ação (Art 2º. § 2º, item VI) está o estabelecimento de uma população arca (back-up) ex-situ, auto-sustentável e geneticamente diversa, que forneça indivíduos para o programa de reintrodução.
Estudos genéticos nas populações remanescentes na Serra da Canastra indicaram uma baixa diversidade e um alto nível de cruzamento entre parentes próximos (ICMBIO, 2020), tornando-se imprescindível que ações sejam desenvolvidas para incrementar o pool genético da espécie. A criopreservação de gametas é uma ferramenta que pode ser utilizada para a formação de um banco de germoplasma, sendo que o primeiro passo é a obtenção de sêmen em quantidade e qualidade suficientes para o congelamento. Desta forma, este projeto tem por objetivos estabelecer a técnica de coleta de sêmen para pato-mergulhão, descrever as características do ejaculado, analisar a qualidade do sêmen e desenvolver um protocolo de criopreservação para o sêmen da espécie.

Animais
O período reprodutivo do pato-mergulhão em cativeiro ocorre de junho a outubro; nestes meses será feita a coleta em 02 machos de pato mergulhão (Mergus octosetaceus) mantidos em cativeiro no Zooparque Itatiba-SP. Quando o pato mergulhão não estiver no perídodo reprodutivo, serão utilizados machos da mesma família (Anatidae), que apresentam período reprodutivo durante o ano inteiro em cativeiro, para estabelecer as técnicas de coleta, análise e criopreservação de sêmen. Serão utilizados 02 machos de marreco Carolina (Aix sponsa) e 03 machos de marreco Mandarim (Aix galericulata) também mantidos em cativeiro no Zooparque Itatiba-SP. Desta forma, as técnicas poderão ser validadas antes de iniciar o período reprodutivo do pato-mergulhão.

Coleta de sêmen
O sêmen será coletado utilizando-se o método de massagem abdominal (Quinn e Burrows, 1936), duas vezes por semana, durante todo o período reprodutivo da espécie em cativeiro. Serão utilizados capilares de microhematócrito para obter o sêmen na base do falo. Após a coleta, o sêmen será transferido para tubos Eppendorf, onde será observado o aspecto, será medido o volume e será feita a diluição (1:4, vol:vol) com diluente de Lake. Após diluição, serão separadas alíquotas para análise de motilidade, integridade de membrana, morfologia e concentração. O restante do sêmen será imediatamente refrigerado a 5°C para posterior criopreservação.

Análise de sêmen
O sêmen será analisado antes do congelamento (fresco) e após o descongelamento.
A motilidade será observada subjetivamente ao microscópio (Van der Laan, 2007). Serão preparadas duas lâminas com o sêmen diluído e os espermatozoides serão classificados em uma escala de 0 a 100%, sendo 0 todos imóveis e 100 todos móveis.
A integridade de membrana e a morfologia espermática serão analisadas utilizando-se a coloração eosina-nigrosina (Bakst, 2010). Serão contados 100 espermatozoides, categorizados quanto à integridade de membrana como íntegros (sem coloração) ou mortos (corados com eosina) e quanto à morfologia como normais ou com defeitos. Os defeitos serão classificados como defeitos de cabeça, de cauda ou de peça intermediária.
A concentração espermática será verificada utilizando-se hemocitômetro (Bakst, 2010), para obtenção do número de espermatozoides por mL de sêmen.

Criopreservação
O congelamento de sêmen será feito com o crioprotetor dimetilacetamida (DMA) (Tselutin et al., 1999), com protocolo modificado (Bongalhardo et al, 2007). Após 10 minutos de refrigeração a 5°C, o crioprotetor será adicionado ao sêmen (concentração final de 6%). O sêmen será homogeneizado e equilibrado por 1 min, quando será envasado em palhetas de 0,25mL. As palhetas serão seladas e expostas ao vapor de nitrogênio por 1 minuto antes de serem congeladas por imersão no nitrogênio líquido. O descongelamento será feito através da imersão das palhetas em banho-Maria a 40°C por 30 segundos. As duas extremidades das palhetas serão cortadas e o sêmen será depositado em tubos e mantido à temperatura ambiente para análise.

Análise estatística
Será feita análise univariada para cada característica estudada (volume, concentração, motilidade, morfologia e integridade de membrana) com a finalidade de descrever os padrões seminais do pato mergulhão, do marreco Carolina e do marreco Mandarim. Análise de medidas repetidas será feita para comparar as características do sêmen antes e depois do congelamento. Todas as análises serão feitas usando o programa Statistix (Statistix, 2003).

Ao final deste projeto, espera-se obter um protocolo eficiente pra a criopreservação de sêmen de pato-mergulhão, o que possibilitará a formação de um banco de germoplasma o que, por sua vez, garantirá a diversidade genética da população. Este resultado vem ao encontro da estratégia de ação proposta pelo segundo ciclo do PAN para a conservação do pato mergulhão: o estabelecimento de uma população ex-situ geneticamente diversa que forneça indivíduos para o programa de reintrodução.