Nome do Projeto
Efeitos do herbicida glifosato na expressão de genes associados ao eixo somatotrófico em larvas do peixe-rei Odontesthes spp.
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/12/2021 - 30/11/2023
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
A aplicação de insumos agrícolas nos monocultivos transgênicos cresceu de maneira expressiva a partir dos anos 60 com a Revolução Verde, e apesar dessa tecnologia propiciar um grande aumento na produção das lavouras, diversos problemas ambientais associados à prática ameaçam a sobrevivência da biodiversidade não-alvo nos ecossistemas terrestres e aquáticos. Já é conhecido que o glifosato, herbicida de ação não seletiva, causa efeitos nocivos a muitos grupos de vertebrados, incluindo os peixes do gênero Odontesthes, que tem sua sobrevivência afetada por altas taxas de mortalidade, efeitos teratogênicos e danos fisiológicos. Estes peixes-rei, como são popularmente conhecidos, são apreciados para o consumo humano e apresentam importância econômica pesqueira bem como potencial na aquicultura, além de se mostrarem excelentes modelos biológicos em estudos gênicos. Sabendo que um dos danos causados pelo glifosato em peixes é a redução no crescimento, o objetivo dessa pesquisa é analisar a participação de genes do eixo somatotrófico nesse processo, e assim validá-los como biomarcadores de exposição. A hipótese é de que o potencial genotóxico do glifosato afetará a expressão de genes associados ao eixo somatotrófico. Para isso larvas de Odontesthes serão submetidas a exposições de 0,36mg/L e 1,8mg/L de glifosato pelo período de 96h. Ao fim do experimento, a biometria em peso (mg) e comprimento de notocorda (mm) será realizada e as larvas serão armazenadas em RNAlater para análise por Real Time –qPCR, da expressão dos genes para o hormônio do crescimento (pjGH), seus receptores GHR-I e GHR-II, e fatores de crescimento semelhantes a insulina (IGF-I e IGF-II), em comparação aos genes Histona 3 a (h3a) e β-actina (β-actin) como normalizadores da expressão. Caso os resultados corroborem com a hipótese proposta, será possível considerar a expressão de tais genes como biomarcadores de toxicidade do glifosato na espécie estudada.
Objetivo Geral
Avaliar efeitos morfológicos e genotóxicos da exposição aguda (96h) ao herbicida a base de glifosato na sobrevivência e crescimento de larvas do peixe-rei Odontesthes spp.
Justificativa
Sendo as espécies de peixe-rei (Odonthestes spp.) relevantes como recurso pesqueiro, como espécies produzidas na piscicultura e também indicads como sentuinelas ambientais. é de suma importância o conhecimento dos possíveis impactos causados pelo herbicida mais empregado no Brasil e na região em estudo, sobre o desenvolvimento dessas espécies. tais conhecimentos permitirão o ajuste de manejo seja no ambie nte natural e pesca como no cativeiro.
Metodologia
Coleta e desenho experimental
Ovos de peixe-rei serão coletados junto aos pescadores e mantidos no Laboratório de Fisiologia de Animais Aquáticos/UFPel (CEEA no. 23110.019099/2020-23). Após a eclosão das larvas e um período de aclimatação de 10 dias, os animais serão selecionados aleatoriamente para o início do experimento.
O ensaio será realizado em triplicata com 20 indivíduos por réplica, submetidos a dois tratamentos de exposição 0,36mg/L e 1,80mg/L de glifosato com base na formulação Roundup Transorb® (RT), mais o grupo controle. Antes do início do experimento, uma biometria inicial com 10 indivíduos será feita para comparação com os resultados ao término do ensaio.
Cada unidade experimental estará composta por aquários plásticos (36L), com temperatura controlada (22ºC), aeração constante, fotoperíodo 12:12h, salinidade 0ppm e pH 7,5.
Os animais serão submetidos a estas condições pelo período de 96h.
Durante a exposição, as larvas serão alimentadas ad libitum duas vezes ao dia com Artemia sp. A cada 24h, se coletarão amostras de água (200mL) para avaliação dos parâmetros de qualidade do meio experimental e posterior dosagem de glifosato.
Eutanásia e coleta de tecidos
Ao fim do ensaio, os animais serão individualmente eutanasiados com benzocaína (250ppm) e os valores de biometria em termos de comprimento da notocorda (mm) e peso (mg) serão obtidos. Após, as larvas serão armazenadas em micro tubos Eppendorf contendo RNA Later e congeladas em nitrogênio líquido, para as análises moleculares.
Análises Moleculares
Para analisar a expressão gênica dos genes alvo Growth hormone (GH), Growth hormone receptor-I (GHR-I), Growth hormone receptor-II (GHR-II), Insulin-like growth factor-I (IGF-I), Insulin-like growth factor-II (IGF-II), se utilizarão as larvas inteiras, ou seja, sem coleta de tecidos específicos. O gene normalizador aplicado será Histone 3 a (h3a) de acordo com SILVEIRA et al., 2018 e b-actin seguindo GÓMEZ-REQUINI et al., (2012). No processo de rompimento dos tecidos será utilizado um Reagente Homogeneizador. O RNA se extrairá pelo reagente TRIzol® (Invitrogen), após, o mRNA será reversamente transcrito em cDNA com a utilização do kit Gene Racer (Invitrogen) seguindo o protocolo do fabricante. A expressão dos genes alvo será determinada por real-time quantitative PCR (RT-qPCR) em um termociclador, utilizando Histone 3 a (h3a) e b-actin como genes de referência. As amplificações se darão da seguinte maneira: 94C durante 2 min., 40 ciclos de reação compostos por 20s a 94ºC, 20s a 52º-58ºC, e 40s a 72ºC, e alongamento final de 2 min a 72ºC (GÓMEZ-REQUINI, et al., 2012). Os primers utilizados para as análises RT-qPCR para os genes de referência e genes-alvo seguem os estudos de Goméz-Requeni et al., 2012 e Silveira, et al., 2018. Primers: GH-f1, GH-r1, GHRI-f1, GHRI-r1, GHRII-f1, GHRII-r1, IGFI-f1, IGFI-r1, IGFII-f1, IGFII-r1, H3A – r1, H3A – f1, β-actin – f e β-actin – r.
Análise Estatística
Os dados serão expressos em média +- erro padrão e analisados por ANOVA de uma via, seguidos pelo teste post-hoc de Tukey. As pressuposições para aplicação de ANOVA serão verificadas pelo teste de Kolmogorov-Smirnov (normalidade) e teste de Cochran (homogeneidade da variância), empregando o software Statistica. Todos os testes seguirão um nível de significância de 5%. Os dados da PCR em tempo real serão analisados pelo método 2-∆∆Ct (onde ΔΔCt = ΔCt amostra - referência ΔC (SCIARA et al., 2008).
Ovos de peixe-rei serão coletados junto aos pescadores e mantidos no Laboratório de Fisiologia de Animais Aquáticos/UFPel (CEEA no. 23110.019099/2020-23). Após a eclosão das larvas e um período de aclimatação de 10 dias, os animais serão selecionados aleatoriamente para o início do experimento.
O ensaio será realizado em triplicata com 20 indivíduos por réplica, submetidos a dois tratamentos de exposição 0,36mg/L e 1,80mg/L de glifosato com base na formulação Roundup Transorb® (RT), mais o grupo controle. Antes do início do experimento, uma biometria inicial com 10 indivíduos será feita para comparação com os resultados ao término do ensaio.
Cada unidade experimental estará composta por aquários plásticos (36L), com temperatura controlada (22ºC), aeração constante, fotoperíodo 12:12h, salinidade 0ppm e pH 7,5.
Os animais serão submetidos a estas condições pelo período de 96h.
Durante a exposição, as larvas serão alimentadas ad libitum duas vezes ao dia com Artemia sp. A cada 24h, se coletarão amostras de água (200mL) para avaliação dos parâmetros de qualidade do meio experimental e posterior dosagem de glifosato.
Eutanásia e coleta de tecidos
Ao fim do ensaio, os animais serão individualmente eutanasiados com benzocaína (250ppm) e os valores de biometria em termos de comprimento da notocorda (mm) e peso (mg) serão obtidos. Após, as larvas serão armazenadas em micro tubos Eppendorf contendo RNA Later e congeladas em nitrogênio líquido, para as análises moleculares.
Análises Moleculares
Para analisar a expressão gênica dos genes alvo Growth hormone (GH), Growth hormone receptor-I (GHR-I), Growth hormone receptor-II (GHR-II), Insulin-like growth factor-I (IGF-I), Insulin-like growth factor-II (IGF-II), se utilizarão as larvas inteiras, ou seja, sem coleta de tecidos específicos. O gene normalizador aplicado será Histone 3 a (h3a) de acordo com SILVEIRA et al., 2018 e b-actin seguindo GÓMEZ-REQUINI et al., (2012). No processo de rompimento dos tecidos será utilizado um Reagente Homogeneizador. O RNA se extrairá pelo reagente TRIzol® (Invitrogen), após, o mRNA será reversamente transcrito em cDNA com a utilização do kit Gene Racer (Invitrogen) seguindo o protocolo do fabricante. A expressão dos genes alvo será determinada por real-time quantitative PCR (RT-qPCR) em um termociclador, utilizando Histone 3 a (h3a) e b-actin como genes de referência. As amplificações se darão da seguinte maneira: 94C durante 2 min., 40 ciclos de reação compostos por 20s a 94ºC, 20s a 52º-58ºC, e 40s a 72ºC, e alongamento final de 2 min a 72ºC (GÓMEZ-REQUINI, et al., 2012). Os primers utilizados para as análises RT-qPCR para os genes de referência e genes-alvo seguem os estudos de Goméz-Requeni et al., 2012 e Silveira, et al., 2018. Primers: GH-f1, GH-r1, GHRI-f1, GHRI-r1, GHRII-f1, GHRII-r1, IGFI-f1, IGFI-r1, IGFII-f1, IGFII-r1, H3A – r1, H3A – f1, β-actin – f e β-actin – r.
Análise Estatística
Os dados serão expressos em média +- erro padrão e analisados por ANOVA de uma via, seguidos pelo teste post-hoc de Tukey. As pressuposições para aplicação de ANOVA serão verificadas pelo teste de Kolmogorov-Smirnov (normalidade) e teste de Cochran (homogeneidade da variância), empregando o software Statistica. Todos os testes seguirão um nível de significância de 5%. Os dados da PCR em tempo real serão analisados pelo método 2-∆∆Ct (onde ΔΔCt = ΔCt amostra - referência ΔC (SCIARA et al., 2008).
Indicadores, Metas e Resultados
Espera-se determinar níveis de segurança ambiental de glifosato para o desenvolvimento da espécie estudada; Espera-se encontrar resultados que demonstrem e permitam inferir sobre os danos fisiológicos e alterações genéticas da espe´cie em funçãop da toxicidade do glifosato; estabelecer limites de segurança para a exposição da espécie ao glifosato.
Equipe do Projeto
| Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
|---|---|---|---|
| GILSON DE MENDONCA | 2 | ||
| MAIDANA DA SILVA IDIARTE | |||
| NIVIA MARIA STREIT | |||
| RICARDO BERTEAUX ROBALDO | 10 | ||
| VINICIUS FARIAS CAMPOS | 1 | ||
| VINICIUS VALENTE ACOSTA |