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Os ambientes aquáticos vem sofrendo alterações por atividades antrópicas (DALLAS, 2008) como redução dos níveis de mananciais devido ao excesso de captação para consumo humano (OLDEN, 2010). A transferência entre bacias e uso da água para irrigação na agricultura, com a descarga da água modificada em seu ambiente de origem (WELLBORN, 1996), ou indiretamente por alterações ambientais pelo uso da terra, como a remoção da mata ciliar e emprego de agrotóxicos (RUTHERFORD, et al., 1997) também são ações danosas ao meio. Trabalhos sobre impactos antropogênicos em ambientes aquáticos são densamente produzidos com a finalidade de prever, quantificar e atenuar os danos ambientais (BLOOMFIELD, et al., 2006;CALOSI, 2008; CHAO, et al., 2020; DE BEECK, 2017). Esses danos vem se agravando com o desenvolvimento e captação de recursos naturais para suprir a crescente demanda de consumo. O uso das terras e o despejo de insumos em corpos d’água são práticas antigas na sociedade. Estudos que quantificam a lixiviação de insumos para o solo e corpos d’água são necessários tanto para medir o impacto nos habitats atingidos, quanto para corroborar com a reformulação do uso de produtos ou práticas antropogênicas tidas como ambientalmente perigosas (BORGGAARD, 2008). Banhados e lagos temporários são habitats muito explorados por diversos grupos de animais e plantas, tais ambientes possuem oscilações muito particulares nos fatores abióticos com altas variações na temperatura e nos níveis de oxigênio, pH e condutividade (VOLCAN, 2011). Por ser um ambiente extremófilo seus residentes normalmente se encontram em suas máximas tolerâncias físico-químicas, sendo suscetíveis aos impactos gerados pela contaminação por insumos advindos de práticas agrícolas. Segundo Zebral (2018) para espécies adaptadas à ambientes termo extremófilos, o custo metabólico de respostas de detoxificação pode contribuir com a redução da tolerância térmica e comprometer o desenvolvimento e a sobrevivência das populações. Esse tipo de contaminação põe em perigo uma gama de espécies residentes deste habitat, através do estresse oxidativo, queda da tolerância térmica, redução no tempo de vida e perda da mobilidade, podendo culminar em um desequilíbrio ou na extinção de espécies já ameaçadas (ZEBRAL, et al., 2018). A contaminação direta de rios e a chuva acabam destinando produtos como o glifosato e seus compostos para este tipo de ambiente, promovendo alterações na fisiologia dos indivíduos expostos, que necessitam alocar energia para o processo de detoxificação, algumas vezes em detrimento de outras funções homeostáticas, como a tolerância térmica, por exemplo (Zebral, et al., 2018) e o crescimento.

Área de Estudo
A área de estudo será um banhado localizado no Campus Capão do Leão, da Universidade Federal de Pelotas, Capão do Leão, Rio Grande do Sul, Brasil (31°48’25”S & 52°25’11”W). Segundo Volcan (2011) este ambiente apresenta águas rasas de até 30 cm de profundidade e possuí uma grande diversidade de macrófitas, invertebrados e vertebrados. O local permanece inundado durante o hidroperíodo de 6 a 8 meses/ano, a partir do final do outono, início do inverno (maio-junho) até o final da primavera e início do verão (novembro-dezembro) quando, geralmente, seca até a próxima estação de chuvas.

Delineamento Experimental
O experimento será realizado no Laboratório de Fisiologia Aplicada à Animais Aquáticos e será constituído de um grupo controle (sem herbicida) e dois grupos com exposições ao herbicida RT em concentrações de 0,1 e 1mg/L (e.a.) por 24h. Cada inseto será individualmente exposto ao herbicida em aquários de 3L, e ao término de 24h de exposição os animais serão transferidos para um aquário idêntico, onde passarão pelos testes de CTMax e CTMin.

Insetos
Para o experimento será utilizado o quarto instar da larva (L4) do mosquito Culex quinquefasciatus, e juvenis da barata-d’àgua Belostoma sp. Ambas espécies serão coletadas (n=30/espécie) no banhado do Campus da UFPel, e serão levadas ao laboratório. As coletas serão feitas com puçá, acompanhando-se o esforço amostral pela número de vezes que o puçá for empregado e a área amostrada em cada arrasto do puçá, até que se colete o total necessário. No laboratório os insetos que serão submetidos aos testes permanecerão em aclimatação por 24h, isolados individualmente em aquários de 3L em temperatura ajustada à temperatura média observada no ambiente no dia da coleta. A temperatura será verificada in loco as 8:00 e as 14:00h. Os insetos do grupo teste também permanecerão nessas mesmas condições acrescidas do herbicida. Não haverá alimentação durante os ensaios.

Testes de CTMax e CTMin
A metodologia será ajustada a partir do proposto por Coccia et al. (2013). Para determinação do CTMax os insetos serão transferidos individualmente para o aquário teste (com mesma forma e volume dos aquários de manutenção), onde a temperatura será aumentada em taxa de 0,3 a 0,5oC por minuto. Durante o ensaio, serão computados a cada minuto os valores crescentes da temperatura e o comportamento do animal. O endpoint será caracterizado pela temperatura na qual o inseto sofre perda da atividade locomotora e ou da organização dos movimentos com perda de orientação. No caso das larvas de mosquitos o endpoint é caracterizado pela subida à superfície da água, com ausência de movimentos e sem resposta a perturbação física (DELNAT, et al., 2019) e no caso dos hemípteros é relatada a perda da locomoção e coordenação dos movimentos (PORTER, 2019). Neste ponto o exemplar é imediatamente capturado e transferido para água isenta de tóxico, nas mesmas condições pré-experimentais, por um período de recuperação de 24h, para atestar sua sobrevivência ao teste, confirmando o valor do CTMax. O grupo controle seguirá o mesmo procedimento, porém sem exposição ao tóxico. Os testes para CTMin seguirão o mesmo protocolo, porém com redução gradual da temperatura (0,3 a 0,5oC/min). Serão testados 10 indivíduos por grupo experimental. Encerrado o tempo de recuperação os animais serão sacrificados por sedação prolongada em banho de eugenol (400mg/L), serão pesados e medidos e depois descartados junto ao biotério central da UFPel.

Determinação do Glifosato
A concentração do glifosato será quantificada conforme descrito por Borjesson e Torstensson (2000). A técnica consiste em uma extração líquido/líquido com 150mL de amostra (pH 2,0/HCl). Extração em meio de acetato de etila e acetonitrila (1:1; 3x20mL). A fase aquosa será descartada e a fase orgânica evaporada com nitrogênio e ressuspendida com anidrido trifluoracético e trifluoretanol para a reação de derivatização. Na última etapa a amostra é ressuspendida em acetato de etila e analisada por cromatografia gasosa com detecção fotométrica de chama.

Análise estatística
Os dados serão apresentados na forma de média ± desvio padrão e aqueles referentes CTMax e CTMin serão testados mediante ANOVA. As pressuposições para a ANOVA serão avaliadas pelos testes de KolmogorovSmirnov (normalidade) e teste de Cochran (homogeneidade da variância) com emprego do programa Statistica 7.0®. Diferenças significativas entre médias serão determinadas pelo teste a posteriori de Tukey. As médias de sobrevivência (%) serão comparadas pelo teste de Kuskal-Wallis. Todos os testes considerarão um nível de significância de 95% (p<0,05).

Espera-se determinar os níveis mínimos do agrotóxico estudado que apresentam efeitos deletérios sobre a ecofisiologia dos insetos. dados indispenssáveis na avaliação de impactos ambientais antropogênicos para nossa região que intensifica e amplifica constantemente o uso de glifosato com os novos cultivares, como o de soja na região.