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A termotolerância dos bovinos tem sido um assunto amplamente discutido nos últimos anos, dada a crescente demanda por produtos de origem animal e o apelo da produção associada ao bem-estar animal (GERALDO, 2013). Condições ambientais adversas de temperatura, principalmente na estação quente, desencadeiam um quadro de estresse térmico, que culmina na diminuição da produção, queda de desempenho reprodutivo e afeta negativamente a função imune, predispondo o animal à ocorrência de enfermidades (AMARAL at al., 2020; JOO et al., 2021; RECCE et al., 2021). Além disso, também ocorrem perdas diretas no ganho de peso e padrão de deposição de gordura, bem como, existem perdas indiretas geradas pelo desinteresse do consumidor final, devido à redução da qualidade do produto (GERALDO, 2013; NOVO et al., 2020; MATEESCU et al., 2017).
A seleção animal como fator determinante para a manutenção de características desejáveis no rebanho, vem sendo realizada desde os primórdios das criações. Contudo, o foco tem sido mantido apenas no aumento da produção sem considerar os potenciais de adaptabilidade (MOURA, 2019). Atualmente, mais de metade dos bovinos do mundo é criada em ambientes de clima quente e úmido (MATEESCU et al., 2017). No Brasil, em meio ao clima tropical, surge a necessidade de criar animais que consigam boas respostas produtivas, com ótima qualidade de carne e leite e sob o menor estresse térmico possível (ESPINOZA et al., 2011;).
No Sul do Brasil, as raças europeias como a raça Aberdeen Angus são bastante difundidas, porém, a maior parte do rebanho nacional tem base em raças zebuínas (MCT, 2010). As raças europeias são reconhecidas por sua carne de maior marmoreio e maciez, por isso há um aumento do apelo pela adaptabilidade destes animais, que propiciará a expansão da raça para climas mais quentes, tanto em rebanhos puros como em cruzamentos industriais Bos taurus X Bos indicus (MATEESCU et al., 2017; MACEDO et al., 2014; DAVILA et al., 2019).
Mesmo dentro de uma raça, determinadas características podem tornar o animal mais termotolerante, como a seleção por pelame, que já vem sendo utilizada nos programas de seleção genética (NATURA, 2019; CONEXÃO DELTA G, 2019) e que está diretamente relacionado com a adaptabilidade. Nesse programa, além do comprimento, existem indicativos de que a coloração da pelagem também influencia na resistência do animal ao calor, visto que pelos pretos possuem elevada absorbância de radiação (SILVA et al., 2003).
Em bovinos, as referências que comparam o desempenho de animais com diferentes colorações de pelagens em estresse térmico são limitadas. No gado leiteiro, a grande maioria dos trabalhos segmenta os grupos de acordo com a porcentagem de manchas pretas em relação às brancas. Ademais, alguns estudos são realizados com animais confinados, em condições que não refletem condições naturais e assim, impedem a manifestação dos sinais clínicos e efeitos negativos do estresse térmico(ALZURES-OLVERA et al., 2019; DIKMEN et al., 2017).
Animais predominantemente de pelagem preta (em relação à branca), em sistemas a pasto ou expostos experimentalmente ao estresse térmico, apresentam maior frequência respiratória (GAUGHAN et al., 1998), maior temperatura retal e superficial (HILLMAN et al., 2001). Isola et al. (2020) ao compararem vacas Holandês vermelhas e brancas (HVB) e pretas e brancas (HPB), observaram que na estação quente, a temperatura tanto das manchas pigmentadas como de não pigmentadas e a temperatura retal foram inferiores em vacas HVB. Em um estudo realizado por Brown-Brandla (2006), vacas Angus de coloração preta tiveram maior frequência respiratória, maior taxa de ofegação e maiores temperaturas de superfície em relação à outras raças de corte com pelagens vermelha ou branca.
A termorregulação é a capacidade do animal manter a temperatura do corpo estável, minimizando problemas provenientes da variação da temperatura ambiente (SILANIKOVE, 2000). Dentre estes mecanismos de termorregulação, destacam-se o aumento da frequência respiratória e o ato de lamber-se ou molhar-se para intensificar e facilitar a perda de calor para o ambiente (MCFARLAND, 1999; BLACKSHAW et al., 1994). Como nos bovinos o principal mecanismo para perda de calor é a evaporação (NARDONE et al., 2006), quando a umidade relativa do ar é alta, as perdas de calor por difusão de água são diminuídas à tal ponto que o animal passa a receber calor do ambiente (TITTO, 1998).
O índice de temperatura e umidade (THI, do inglês Temperature and Humidity Index) é uma ferramenta amplamente utilizada para identificação de estresse térmico a partir de variáveis ambientais – temperatura e umidade. O THI foi criado para humanos por Thom em 1958 e adaptado para bovinos (NOAA, 1976), mediante a seguinte fórmula: THI = (1.8 × Temperatura + 32) - (0.55 - 0.0055 × Umidade relativa) × [(1.8 × Temperatura + 32) - 58)]. O índice obtido permite a classificação da condição térmica: ausência de estresse (THI < 70), alerta (70>THI<78), perigo (78>THI<82) e emergência (THI > 82) (DU PREZZ et al., 1990). Todavia, Coollier et al. (2012) ressaltam que vacas leiteiras de alta produção (volume > 35kg/leite/dia) apresentam queda de produção e alterações fisiológicas em THI superiores a 68.
O estresse térmico acontece quando o animal precisa alterar de maneira extrema sua fisiologia e comportamento, com o intuito de manter a temperatura interna estável (SELYE, 1976). Quando os mecanismos de termorregulação falham e o estresse térmico é desencadeado, o comportamento animal muda e a produtividade é comprometida (SILVA, 2005). Quanto ao comportamento, os animais diminuem o pastejo e a ambulação, buscam sombra, isolam-se de seus companheiros, deitam-se na tentativa de aumentar a superfície de troca com o ambiente, buscam pisos frios e molham a superfície corporal com água (PIRES et al., 1999). Além disso, a taxa de ruminação está correlacionada positivamente com o tempo de pastejo (ARIAS et al., 2021) e produção de leite, mas negativamente com o THI; esta correlação é mais intensa em vacas de alta produção (MUSCHER et al., 2020). Muscher et al., (2020) destacam que a ruminação é afetada pelo THI em um limiar de 52, entretanto, esse limiar deve ser ajustado para cada região específica, já que a susceptibilidade ao estresse térmico é influenciada pelo componente genético de termotolerância.
A avaliação da condição dos animais pode ser determinada mediante avaliação de diferentes parâmetros clínicos (taxa respiratória, temperatura corporal, taxa de sudação) e de expressão gênica (proteínas de choque térmico).
Quanto aos parâmetros clínicos, a taxa de respiração tem sido descrita como um bom indicador para avaliação de estresse térmico, bem como a taxa de ofegação (BROWN-BRANDL et al., 2005; ARIAS et al., 2021), já que existe uma relação linear entre o agravamento da taxa de ofegação e o aumento do THI (Veisser et al., 2017). Da mesma forma, a temperatura corporal é um importante parâmetro de conforto térmico. Nesse sentido, o acompanhamento diário das variações é fundamental para uma adequada avaliação. Porém, medições frequentes geram vieses relacionados com o manejo ou presença de humanos (BURDICK et al., 2012). Desta forma, o uso de termômetros intravaginais é especialmente útil por ser um método que demanda pouca manipulação do animal e não perturba seu comportamento natural (KAUFMAN et al., 2018). Outra vantagem é que a temperatura vaginal apresenta correlação robusta com o THI (KAUFMAN et al., 2018) e é mais sensível a mudanças na temperatura corporal do que a temperatura retal (BURDICK et al., 2012).
Além da temperatura interna, a temperatura superficial também permite a coleta de informações importantes com relação positiva com as temperaturas retal e vaginal. A avaliação é feita mediante termografia infravermelha que permite a mensuração da temperatura superficial de modo fácil e precoce para diagnóstico do estresse térmico (PENG et al., 2019).
Outro parâmetro de avaliação é a taxa de sudação, que representa uma via evaporativa de termólise eficiente (SILVA, 2000), e que tem sido utilizada em diferentes estudos (MacManus et al., 2009; Pereira et al., 2014; Maurya ey al., 2017; Debbarma et al., 2020), a fim de determinar a capacidade de perda de calor em condições climáticas adversas e identificar animais termotolerantes.
Existem indicações que em condições de estresse térmico, ocorre a ativação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal desencadeando a liberação de cortisol (HARBUZ e LIGHTMAN, 1992). Este hormônio é um importante marcador de estresse, pois está correlacionado positivamente ao THI e a temperatura retal (KIM et al., 2018), além de estimular a expressão de proteínas de choque térmico (PIRES et al., 2019). Ademais, Ghassemi Nejad et al. (2017), ao mensurarem o cortisol capilar de vacas Holandês, observaram que animais com pele predominantemente preta (>80%), apresentaram maior nível que animais predominantemente brancos (>85%). Já, Sanchez et al. (2013), observaram na resposta ao desafio com lipopolissacarídeo, em condições de estresse térmico, maior concentração de cortisol em animais da raça Romosinuano (tolerante ao calor) que em animais Angus (sensíveis ao calor).
Quanto ao parâmetro de atividade de genes de adaptação ao estresse térmico, sabe-se que as proteínas de choque térmico (HSP) auxiliam o processo de enovelamento de proteínas desnaturadas com o aumento da temperatura. O aumento da concentração ou expressão gênica de HSP está associado a maior termotolerância de bovinos, bubalinos e caprinos (Deb et al., 2014; Shenhe et al., 2018; Pires et al., 2019). Dentre as proteínas existentes, as HSP 70 e HSP 90 foram identificadas como as mais importantes em estudos conduzidos com ruminantes (Dangi et al., 2014; Min et al., 2015; Lamy et al., 2017; Kim et al., 2018; Li et al., 2020). A HSP 70 é considerada a proteína mais sensível e atua inibindo a formação, desenvolvimento, translocação e ligação de diferentes moléculas intermediá

O presente projeto, tanto para animais de corte quanto de leite será dividido em duas etapas. Na etapa 01, com um número menor de animais, serão avaliados diversos parâmetros para aferir aspectos gerais relacionados à termotolerância. Após a eleição de quais parâmetros refletem com maior significância a termotolerância dos animais, na etapa 02, será realizado estudo com um quantitativo maior de animais, com foco no desempenho reprodutivo, correlacionado com a termotolerância.

ETAPA 01

Animais e alimentação

Os animais de corte compreenderão 100 novilhas da raça Angus, das pelagens preta (Aberdeen; n=50) e vermelha (Red; n=50), com 12 meses de idade no início das avaliações. Os animais serão mantidos em pastagens cultivadas ou em campo nativo durante todo o período de avaliação, com acesso a água e sal mineral ad libitum. Já os animais de leite compreenderão 30 vacas da raça Holandês vermelho e branco (HVB; n=15) e preto e branco (HPB; n=15). Os grupos serão balanceados de modo que para cada vaca HVB haverá uma vaca HPB equivalente quanto à porcentagem de manchas, escore de condição corporal (escala de 1 a 5, sendo 1 muito magra e 5 muito gorda), peso, produção de leite, dias em lactação e ordem de parição. A medição da porcentagem de manchas será realizada (software ImageJ) avaliando uma foto tirada de todos os animais no lado esquerdo, baseado em um retângulo delimitado por linhas verticais traçadas a partir da inserção da cauda e da borda dorsal da escápula em direção ao chão e pelas linhas dorsal e ventral do animal. A área das manchas pigmentadas contidas no interior desse retângulo, dividida pela área total do retângulo corresponderá a porcentagem de manchas. Os animais permanecerão na pastagem de azevém e aveia (inverno) e tifton (verão) grande parte do tempo e serão direcionados para a ordenha duas vezes ao dia (5 horas e 16 horas). Após, receberão ração em mistura total de silagem de milho, milho grão úmido, farelo de soja e sal mineral.

Épocas de avaliação

Para os bovinos de corte, serão realizados três momentos de avaliação: primeiramente, durante o inverno (julho/agosto 2022), os animais serão avaliados e classificados, utilizando como base sua coloração (preta ou vermelha) e o pelame (1, 2 ou 3; ANGUS, 2018). Também serão feitas avaliações referentes ao peso, escore de condição corporal (ECC – 1 a 5) e escore de trato reprodutivo (ETR – 1 a 5, HOLM et al., 2009). As avaliações citadas serão realizadas novamente durante a primavera (outubro/novembro 2022) e verão (janeiro 2023), para avaliar a evolução dos parâmetros. Durante a avaliação do verão, que terá a duração de sete dias, também serão analisados outros parâmetros, conforme será descrito abaixo.
Para os bovinos de leite, as avaliações ocorrerão na estação fria (agosto de 2022) e quente (janeiro de 2023) e cada qual com duração de sete dias, ensolarados e com condições representativas de cada estação.

Determinação do índice de temperatura e umidade (THI)

Durante as avaliações nos bovinos de leite e na avaliação do mês de janeiro nos bovinos de corte, será determinado o THI. O índice será calculado com base nos dados obtidos de um termohigrômetro que determinará a temperatura ambiente e umidade relativa do ar. As variáveis serão aplicadas na fórmula [THI = (1.8 × T + 32) - (0.55 - 0.0055 × UR) × [(1.8 × T + 32) - 58)], sendo T a temperatura e UR a umidade relativa). Será considerado que um THI > 70 caracteriza um ambiente de estresse térmico.

Parâmetros reprodutivos

Nas avaliações a serem realizadas no mês de janeiro (corte e leite), serão avaliados os seguintes parâmetros reprodutivos nos animais:
1 – Dosagem de progesterona (P4) – Visando verificar se o estresse térmico afeta a produção de progesterona do corpo lúteo, nos bovinos de corte, após avaliação ginecológica, amostras de sangue serão coletadas (n=15/grupo) de animais no dia 07 do ciclo estral (D0 – ovulação) e permanecerão durante 30 min à temperatura ambiente para a retração do coágulo, sendo posteriormente centrifugadas a 1500xG por 10 min para a separação do soro. O soro será armazenado em tubos criogênicos a -20°C para posterior análise. As dosagens de P4 serão realizadas através da técnica de eletroquimioluminescência (Roche, Brasil), em laboratório comercial.
2 – Avaliação do fluxo sanguíneo no corpo lúteo (CL) – Nos animais que tiverem o sangue coletado e em todos os animais de leite será realizada ecografia com Doppler colorido do CL usando uma escala adaptada descrita para avaliar o CL (PUGLIESI et al., 2017). A escala original foi desenvolvida para classificar os CL em torno do dia 22 da gestação, variando de 0 a 4, sendo adaptada para avaliação em outros momentos do ciclo estral. Ambos os ovários serão examinados pelo mesmo operador durante o exame de todos os animais. A ultrassonografia em modo B será realizada para determinar o diâmetro da CL. A ultrassonografia transretal será realizada com o aparelho de ultrassom Sonoscape E2V-Pro.

Avaliação da temperatura corporal superficial e temperatura vaginal

Para aferição da capacidade e condição termorregulatória dos animais, será aferida a temperatura corporal superficial por meio de um termógrafo (Testo 870-1). As imagens termográficas serão obtidas sempre do mesmo lado dos animais, a uma distância de aproximadamente 4 metros. Será utilizado sempre o mesmo local e horários, após os animais terem permanecido por duas horas na sombra. As avaliações serão realizadas em todos as vacas de leite e em um subgrupo de 15 animais de cada um dos grupos dos animais de corte. Durante o período de avaliação (sete dias), as imagens serão obtidas nos dias 0, 2, 4 e 6. A partir das imagens, serão determinadas as temperaturas superficiais com base na média de cinco pontos, além do ponto mais quente e do ponto mais frio. Nos animais Holandês, a temperatura média será realizada em cinco pontos nas manchas pigmentadas e cinco pontos nas manchas brancas (ISOLA et al., 2020).
Durante os sete dias de avaliação termográfica, os animais permanecerão com um termômetro intravaginal DS1921H-F5# Thermochron High Res 15 to 46°C (iButtonLink, LLC, Suite #117, 1221 Innovation Drive Whitewater, WI 53190 United States), registrando a temperatura a cada 30 min.

Mensuração de marcadores metabólicos

Serão coletadas amostras de sangue dos animais, no momento da realização da termografia (D0, D2, D4 e D6) através de venopunção da veia coccígea em sistema vacutainer, em tubos com ativador de coágulo para obtenção do soro e medição das concentrações dos marcadores metabólicos de estresse térmico: cortisol, proteína de choque térmico 70 (HSP70) e proteína de choque térmico 90 (HSP90).
Os níveis séricos de cortisol serão determinados por eletroquimioluminescência em laboratório terceirizado e as HSP70 e HSP90 serão mensuradas por ELISA, utilizando kits disponíveis comercialmente (Kim et al., 2018).

Avaliação da taxa de sudação

Também no momento da avaliação da temperatura por termografia, será realizado o teste para mensuração da taxa de sudação (SCHLEGER e TURNER, 1965). O método consiste em discos de papel filtro impregnados com cloreto de cobalto 10%, fixados em fita adesiva que, por sua vez, é fixada no animal sobre uma região tricotomizada. O tempo da mudança de coloração (azul/violeta para rosa claro) será mensurado em segundos. A média de tempo dos três discos será aplicada na fórmula (taxa de sudação = 22 x 3.600 / 2,06 x t, sendo t o tempo em segundos), cujo resultado é dado em g/m²/h. A tricotomia será realizada no pescoço na região pré-escapular no mesmo dia da colocação dos termômetros intravaginais.

Avaliações comportamentais

As avaliações comportamentais serão realizadas nos dois momentos experimentais para os bovinos de leite e na avaliação do mês de janeiro para os bovinos de corte. Nos bovinos de leite as variáveis comportamentais serão coletadas com o auxílio de coleiras de ruminação (C-TECH1 (Chip-Inside) - software CowMed®2), que permitem a determinação de tempo de ruminação, atividade e ócio e a taxa de ofegação a cada hora. Nos bovinos de corte, além de avaliações visuais a campo (frequência respiratória, taxa de ofegação, tempo em pé ou deitado, tempo à sombra ou ao sol e manifestação de cio), realizadas três vezes ao dia. Também será utilizado o BRINCOW® (https://brincow.com), que permite coletar dados como: localização do animal na pastagem (determinando tempo a sombra, acesso a bebedouro, movimentação) e por ser equipado com acelerômetro também fornece dados de ruminação e detecção de cio.

Genotipagem

Na primeira avaliação por termografia, visando a obtenção de material genético dos animais, serão coletados pelos da cauda. A partir desses pelos será realizada a extração de DNA, seguindo a metodologia descrita por Dikmen et al., (2014). Essa etapa será realizada por prestador de serviço terceirizado, que realiza as genotipagens para os programas de melhoramento genético das raças.

ETAPA 02

Após as análises dos dados obtidos na Etapa 01 e determinação de quais parâmetros refletem com maior significância a termotolerância dos animais, o estudo será ampliado para um número maior de animais. Sempre serão utilizados estabelecimentos comerciais de corte e leite, com foco em avaliações reprodutivas que, além das previamente descritas, incluirão dados como taxa de prenhez, perdas gestacionais precoces ou tardias. Nessa segunda etapa, além das avaliações reprodutivas também serão coletados dados de produção.
Os animais de corte a serem utilizados tanto na etapa 01 (n=100) quanto na etapa 02 (n=400) fazem parte do Programa de Melhoramento de Bovinos de Carne (PROMEBO®) que avalia características como: Peso ao nascer (PN), Ganho de peso do nascimento à desmama (GND), Habilidade materna para GND (H MAT), Ganho de peso da desmama ao sobreano (GDS), Ganho de peso do nascimento ao sobreano (GNS), Escores para conformação, precocidade, musculatura e tamanho (CPMT), Escores para Pelame (PM), entre outros (ANGUS, 2018).
Para os a

Espera-se que animais com pelame mais curto, portadores do gene de pelo liso, e de pelagem vermelha sejam animais mais termotolerantes, apresentando melhores índices produtivos, reprodutivos e de bem-estar, bem como menor produção de proteínas de choque térmico. Animais termotolerantes mantém a temperatura corporal interna estável em situação de termoneutralidade e estresse calórico. Em condições de estresse térmico, nesses animais, encontra-se menor temperatura corporal superficial, diminuída taxa de ofegação, taxa de sudação superior e maior tempo de ruminação. A determinação de fenótipo mais termotolerante permitirá a inclusão de avaliações a serem utilizadas em programas de melhoramento genético tanto de bovinos de corte quanto de leite. Além disso, a proposta prevê a utilização/validação de um instrumento de coleta de dados comportamentais (Brincow®) que poderá ser utilizado em larga escala, permitindo a avaliação objetiva de dados comportamentais para posterior mensuração de seus efeitos nos índices produtivos e reprodutivos.
Os dados coletados nos experimentos propostos permitirão determinar as variáveis a serem consideradas em avaliações futuras, permitindo que haja um número maior de animais avaliados, podendo inclusive levar à aplicação de ferramentas como GWAS (Estudo de Associação em Genoma Completo) para seu uso em programas de melhoramento genético das diferentes raças.