Nome do Projeto
Obtenção de filmes de Poli-3-hidroxibutirato [P(3HB)] coloridos através da aplicação de corantes naturais e sintéticos no processo fermentativo da bactéria Ralstonia solanacearum cepa RS
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
15/01/2022 - 30/12/2025
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Multidisciplinar
Resumo
A presente proposta objetiva pesquisar uma metodologia inovadora de obtenção de filmes do bioplástico poli-3-hidroxibutirato [P(3HB)] coloridos através de processo fermentativo submerso utilizando a bactéria Ralstonia solanacearum cepa RS com corantes naturais e sintéticos. Para tal, os corantes serão adicionados ao meio de cultivo da bactéria visando que, durante a síntese do bioplástico, ocorra simultaneamente a coloração, eliminando a etapa de coloração posterior do biopolímero. O processo fermentativo será avaliado quanto ao crescimento celular e produção do P(3HB), verificando assim possível interferência dos corantes no crescimento celular. Após a obtenção dos filmes coloridos, esses serão caracterizados quanto à coloração macro e microestrtutural, resistência à fotodegradação e degradação térmica e fixação dos corantes. Após, será formulado um produto cosmético glitter biodegradável utilizando o P(3HB) colorido por processo de fermentação submersa e pó de mica.

Objetivo Geral

O objetivo da presente pesquisa propõe uma nova metodologia de obtenção de filmes do bioplástico poli-3-hidroxibutirato [P(3HB)] coloridos através de processo fermentativo submerso utilizando a bactéria Ralstonia solanacearum cepa RS com corantes naturais e sintéticos.

Justificativa

Materiais plásticos fornecem uma gama de usos variados, por possuírem propriedades físicas atrativas à confecção de produtos comerciais. Devido sua durabilidade e relativo baixo custo de produção, podem ser encontrados em diversos setores industriais. Por apresentarem uma durabilidade notável, podem representar um risco em potencial para os ecossistemas naturais, em razão de seu acúmulo ambiental proveniente do descarte inadequado.
O grande impacto ambiental gerado pelos plásticos, os torna um dos principais poluentes ao redor do planeta. O primeiro plástico totalmente sintético foi desenvolvido por Leo Baekeland e data de 1907. Desde então, a produção mundial do polímero ultrapassou mais de 8 bilhões de toneladas, sendo produzidas apenas no ano de 2019 aproximadamente 370 milhões de toneladas do material globalmente. Destes, estima-se que cerca de 50% sejam utilizados na produção de embalagens descartáveis, plásticos de uso único e de disposição imediata. Entretanto, a produção e consumo exacerbado, aliados ao baixo índice de reciclagem e biodegradabilidade, revelam o desequilíbrio ambiental causado pelo descarte inadequado de materiais plásticos nos diferentes ecossistemas.
A substituição do plástico petroquímico por alternativas que apresentem tempo de degradação menor no ambiente é, portanto, uma opção viável à restrição de seu uso. Os polímeros biodegradáveis (biopolímeros) ou bioplásticos são considerados “plásticos verdes” e podem ser produzidos a partir de fontes renováveis e/ou possuir rápida biodegradabilidade. O P(3HB) é um biopolímero da classe dos Polihidroxialcanoatos (PHAs), que possui características físico-químicas semelhantes aos plásticos convencionais, como o polipropileno (PP). Ele se mostra atrativo do ponto de vista ecológico, pois é biocompatível e possui biodegradabilidade superior a dos plásticos convencionais, sendo assim, considerado um bioplástico.
Devido ao seu potencial de substituição aos plásticos convencionais, o P(3HB) apresenta grande espectro de aplicação, como na medicina e na área agroindustrial. Mas apresentam também grande aplicação na produção de filmes para embalagens, principalmente as que acondicionam alimentos.
Somado a isso, o mercado dos biopolímeros que hoje representa cerca de 1% dentro das mais de 360 milhões de toneladas de plásticos produzidas anualmente, tem expandido sua capacidade de produção ao longo dos anos para atender à crescente demanda por materiais que supram as necessidade de aplicações e de produtos inovadores. Dados recentes da European Bioplastics projetam um aumento da capacidade de produção de biopolímeros para 2,87 milhões de toneladas em 2025, especialmente pela produção de PHA´s, e, dentre eles, o P(3HB).
A produção de P(3HB) ainda é pequena em escala industrial quando comparada a de plásticos de origem petroquímica, entretanto, já é uma realidade de mercado ao redor do mundo, sendo possível encontrar empresas produtoras do biopolímero em vários países a exemplo da Biomer (Alemanha), Kaneka (Japão), Imperial Chemical Industries (Londres), Tinan (China) e Bio-On (Itália) o que evidencia o potencial de aplicação do biopolímero.
Nas últimas décadas, as concepções sobre a preservação ambiental passaram por diversas mudanças. O desenvolvimento de produtos chamados “verdes” ou “ambientalmente sustentáveis” têm sido alvo de pesquisas nas mais diversas áreas, pois a consciência ambiental crescente tem gerado efeitos capazes de alterar padrões de consumo e de vida dos indivíduos.
Além do apelo ambiental, que já dá grande destaque a esses itens, outra maneira de torná-los ainda mais atrativos ao consumidor é com a aplicação de cores aos produtos ou suas embalagens. A adição de uma ou mais cores e o próprio design podem ser usados para diferenciar marcas ou mesmo indicar os benefícios de determinado produto, além de serem consideradas como fator importante na decisão de compra de um item. Desse modo, já existem no mercado opções de biopolímeros coloridos industrialmente, como os fabricados em PHA pela empresa Bio-on, embora a mesma não identifique na composição do produto quais os tipos de corantes utilizados na sua produçãp (BIO-ON®).
Corantes e pigmentos são compostos naturais ou sintéticos que, quando processados e aplicados a outras substâncias, podem alterar ou conferir cor a elas. São elementos importantes na composição de diversos itens, pois tem capacidade de torná-los atrativos visualmente, fazendo os produtos parecerem mais agradáveis, desejáveis e informativos.
Há um interesse evidente na utilização de materiais que sejam ambientalmente amigáveis, a exemplo dos corantes naturais em substituição aos corantes sintéticos. Essa mudança pode ser devida ao aumento da consciência ambiental coletiva e do interesse público em produtos inovadores, ecologicamente sustentáveis e mais seguros ao consumidor.
Corantes naturais são obtidos de folhas, frutos, animais, raízes, secreções de insetos, entre outros, e foram por muitos séculos os únicos disponíveis para colorir diversos itens de consumo. São biodegradáveis, atóxicos e, na maioria, não alérgenos e não cancerígenos e obtidos de fontes renováveis.
Os corantes naturais são utilizados não somente no tingimento de produtos têxteis, papéis, couro e tintas, mas também como corantes alimentícios, na aplicação em cosméticos, entre outros.
Ainda que haja opções de biopolímeros coloridos disponíveis comercialmente, a utilização de corantes naturais para coloração de PHB foi pouco estudada até o momento, tendo somente dois trabalhos na literatura científica. LATOS-BROZIO e MASEK (2020) utilizaram como indicadores em embalagens inteligentes e PAGNAN (2014) no estudo da influência da coloração no processo de degradação do biopolímero.
A substituição dos plásticos de origem petroquímica por bioplásticos biodegradáveis já é uma realidade mundial e necessária para a preservação do meio ambiente. Diversos países possuem empresas que produzem o bioplástico P(3HB), um biopolímero da classe dos Polihidroxialcanoatos (PHAs), que possui características físico-químicas semelhantes aos plásticos convencionais, como o polipropileno (PP). Ele se mostra atrativo do ponto de vista ecológico, pois é biocompatível e possui biodegradabilidade superior a dos plásticos convencionais, sendo assim, considerado um bioplástico.

Metodologia

Obtenção do bioplástico em biorreator de bancada
A linhagem de Ralstonia solanacearum cepa RS (SISGEN A91B678) que será utilizada faz parte da coleção de culturas de microrganismos do Laboratório de Tecnologia de Bioprocessos da Universidade Federal de Pelotas, mantida sob liofilização. A produção de P(3HB) será realizada em duas etapas. A primeira é o preparo do inóculo que será realizado utilizando frascos Erlenmeyers aletados de 500 mL contendo 200 mL de meio YM (extrato de malte 2,7 g.L-1, extrato de levedura 2,7 g.L-1, peptona 4,5 g.L-1 e sacarose 40,0 g.L-1) e suspensão bacteriana obtida através de repiques multiplicativos. Os frascos serão incubados em agitador orbital (Sartorius BBraun - Certomat BS-1) na temperatura de 32 °C e 150 rpm por 24 h. A segunda etapa será realizada nas mesmas condições descritas para o inóculo exceto o tempo que será de 72 h e utilizando o meio de acúmulo de biopolímero MM (cloreto de cálcio, 0,02 g.L-1; fosfato de potássio monobásico, 1,5 g.L-1; fosfato de sódio 4,5 g.L-1; sulfato de amônia, 1,5 g.L-1; sulfato de magnésio, 0,2 g.L-1) (ATLIĆ et al., 2011).
Para extração do P(3HB), inicialmente o caldo fermentado será centrifugado a 10.000 x g durante 30 min a 4 ºC. Os pellets celulares gerados serão secos em estufa a 70 °C até peso constante e posterior trituração. A extração de polímero será realizada a partir da massa celular seca (MCS) utilizando clorofórmio 40:1 (v/m). A amostra será mantida em tubos de ensaio com tampa de rosca disposta em banho-maria na temperatura de 58 °C por 30 min, submetida à agitação em vórtex a cada 5 min. Após, a amostra será transferida para funil de decantação com adição de 40 partes de água destilada, sendo levemente agitada e deixada em repouso para a separação de fases. A fase orgânica será transferida para placas de Petri de vidro (60 x 15 mm) semi abertas para a lenta evaporação do solvente e formação do biofilme sob agitação de 80 rpm em agitador horizontal orbital de placas (Kline, GT201BDU) em capela de exaustão de gases a temperatura ambiente (MACAGNAN, 2014).

Adição dos corantes naturais e sintéticos no processo fermentativo
Serão adquiridos os corantes naturais: páprica, urucum, mostarda, cúrcuma e hibisco (Sabão Glicerina - São Paulo, Brasil), bem como os corantes sintéticos sulfato de azul de Nilo, vermelho neutro e negro de sudão (NEON Commercial®). Serão preparadas soluções aquosas dos corantes com exceção do negro de sudão que será preparado em solução alcoólica. As soluções dos corantes serão esterilizadas por filtração em membrana de nitrato de celulose 0,22 m (Unifil ®). Após, as soluções serão incorporadas a solução de inóculo.
Serão testadas diferentes concentrações dos corantes no processo fermentativo. Para os corantes naturais serão testadas concentrações variando de 0,5% a 0,25%. Para os corantes sulfato de azul de Nilo e negro de sudão serão testadas as concentrações variando entre 1% a 3% (p/v) e para o vermelho neutro a variação entre 0,005 e 0,02% (p/v).
Como controle do processo será realizada a fermentação submersa da bactéria Ralstonia solanacearum cepa RS sem adição de corante. Os ensaios serão realizados em triplicatas.

Avaliação da influência dos corantes naturais e sintéticos no crescimento bacteriano e na produção do bioplástico P(3HB)

Para avaliar o crescimento bacteriano serão realizadas análises de densidade óptica mensuradas em espectrofotômetro (DO600) ao final da fase de inóculo e durante o processo de fermentação com o meio de acúmulo serão retiradas amostras em 24, 48 e 72 h.
A produção do bioplástico P(3HB) será realizada ao final do processo fermentativo sendo determinados a massa celular seca (MCS) e o acúmulo de P(3HB) por gravimetria. Primeiramente, 50 mL do caldo fermentado será centrifugado (10.000 × g for 15 min). As células frescas serão ressuspensas em solução salina a 0.89% (m/v) e centrifugadas novamente. A MCS será obtida através da secagem dos pellets a 56˚C até peso constante (MACAGNAN et al., 2017). O acúmulo de P(3HB) será determinado por extração química conforme descrito no item 5.1. Após será realizado o cálculo de rendimento, tendo os resultados expressos em porcentagem, conforme a equação 1 abaixo.
% P(3HB) = (P1÷P2) × 100 (1)
Onde P1 é o peso total do bioplástico recuperado e P2 é a MCS.

Caracterização dos filmes de P(3HB) coloridos obtidos por processo fermentativo

Análise macroestrutural da coloração dos filmes de P(3HB)
Para a análise macroestrutural das cores obtidas após a obtenção dos filmes de P(3HB) coloridos e do controle, serão realizados dois testes, um visual registrado por fotografia, onde a captura das imagens das amostras serão obtidas no equipamento Fotodocumentador para gel de eletroforese L-PIX bem como, utilizando o colorimétrico Analisador de cor portátil modelo ACR-1023 (Instrutherm®, Brasil), o qual apresenta os dados no formato de coordenadas RGB, medindo os parâmetros R (red–vermelho – 0 a 1023), G (green–verde – 0 a 1023) e B (blue–azul – 0 a 1023). Serão calculados a média e o desvio padrão para cada amostra em triplicata a partir do software Microsoft Office Excel 2016. Após, o valor médio das triplicatas de cada corante será submetido a plataforma online Easy RGB (http://www.easyrgb.com/en/convert.php) para obtenção da cor correspondente frente a coleção de cores padrão disponíveis no sistema da plataforma.

Teste de Fotodegradação
Para a análise do comportamento da cor dos corantes adicionados ao P(3HB) frente à exposição a luz solar mimetizada, será utilizada uma câmara de envelhecimento construída de acordo com os procedimentos definidos pela norma padrão para Operação de Aparelhos de Lâmpadas Ultravioleta Fluorescente (UV) Para Exposição de Materiais Não Metálicos (ASTM G154-16). A câmara é equipada com 4 lâmpadas UVA de 25W (com espectro de emissão na faixa 350 nm de comprimento de onda).
Serão utilizadas 3 amostras de P(3HB) colorido e do controle com dimensões aproximadas de 1,5 cm x 1,5 cm (Paquímetro Universal Wurth) em uma concentração determinada pelo teste de coloração para cada corante a 28 ºC. As amostras serão avaliadas no início (0 h) e nos intervalos de 64, 128 e 192 h de exposição à luz UVA artificial, sendo expostas em períodos alternados de presença de iluminação (8 h) e ausência (16 h). Sendo as mudanças de variação de cor das amostras registradas por fotografias para a análise visual dos filmes ao longo do período de exposição.
A coloração das amostras será medida utilizando o Analisador de cor portátil modelo ACR-1023 (Instrutherm®, Brasil). Os valores das triplicatas das cores serão convertidos para coordenadas cromáticas L*, a* e b* do sistema CIELab (COMISSION INTERNACIONALE DE L’ECLAIRAGE) com auxílio da plataforma EasyRGB para o cálculo da variação de cor (ΔE) apresentada pelos filmes durante a exposição, através da equação 2 abaixo:
Δ𝐸 = ΔL²+Δa² +Δb² (2)

Em que ΔL*, Δa* e Δb* são os resultados entre as amostras iniciais e finais, esquematizadas pelas equações 3, 4 e 5 (VELHO, 2016):

ΔL*= L* amostra final - L* amostra inicial (3)
Δa* = a* amostra final - a* amostra inicial (4)
Δb* = b* amostra final - b* amostra inicial (5)
A partir dos resultados de variação de cor ΔE das amostras, serão produzidos gráficos utilizando o software GraphPad Prism 7. Para a análise estatística será utilizado o teste de Tukey (ANOVA) com p ≤ 0,05 usando o software Statistix 8. As médias e o desvio padrão serão calculados no software Microsoft Office Excel 2016.

Análise microestrutural da coloração dos filmes de P(3HB) por Microscopia Eletrônica de Varredura
A análise microestrutural da superfície dos filmes de P(3HB) colorido e o controle será realizada através de micrografias obtidas das amostras de antes (0h) e depois da exposição à radiação UVA (192h). Será utilizado um Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV - Jeol, JSM - 6610LV, EUA) equipado com microssonda de Espectrometria de Energia Dispersiva de Raios-X (EDX). A preparação das amostras ocorrerá por recobrimento de uma fina camada de Au em um metalizador (Denton Vacuum DESK V), com voltagem de 20 mA durante 300s e aplicada uma aceleração potencial de 15 kV.

Análise Termogravimétrica
As análises termogravimétricas (TGA) dos P(3HB) coloridos e do controle serão realizadas no equipamento SDT Q600 (TA Instruments, modelo TA60 (EUA). As condições estabelecidas serão: faixa de temperatura entre 30 a 500 °C, sob um fluxo de N2(g) de 100 mL/min, com taxa de aquecimento de 10 °C/min. Para isso, amostras com peso em torno de 0,1 a 0,5 mg serão pesadas e colocadas em um porta amostra de platina hermeticamente fechado.

Teste de fixação dos corantes aos filmes do bioplástico P(3HB) visando a aplicação na área cosmética
Para a verificação do grau de adsorção do corante serão utilizados dois testes distintos.
Para o primeiro teste os corpos de prova com dimensões aproximadas de 1,5 cm x 1,5 cm (Paquímetro Universal Wurth) serão imersos em tubos de ensaio contendo solução que mimetiza o suor humano de acordo com o método referência do Comitê Europeu para Padronização (CEN, 2011), composta por uréia (0,1%), cloreto de sódio (0,5%) e ácido lático (0,1%) em água deionizada, ajustando o pH da solução para 6,5. Os tubos então serão incubados em estufa a 32 ºC e as soluções serão analisadas quanto a fixação da cor fotografias onde a captura das imagens das amostras serão obtidas no equipamento Fotodocumentador para gel de eletroforese L-PIX e a turbidez por espectrofotometria nos tempos de 6, 12 e 24 horas. Para análise de turbidez serão utilizados os comprimentos de onda referente as cores dos corantes utilizados.
Para o segundo teste, os corpos de prova com dimensões aproximadas de 1,5 cm x 1,5 cm (Paquímetro Universal Wurth) serão dispostos sobre o tecido adiposo suíno retirado da região abdominal do animal, não sendo congelado anteriormente (SAEDI E KAMINER, 2013). Es

Indicadores, Metas e Resultados

 Selecionar corantes naturais e sintéticos para aplicação no processo fermentativo submerso utilizando a bactéria Ralstonia solanacearum cepa RS;
 Avaliar a influência dos corantes naturais e sintéticos no crescimento bacteriano e na produção do bioplástico P(3HB);
 Analisar as concentrações dos corantes mais adequada para a pigmentação do bioplástico;
 Obter filmes do bioplástico P(3HB) colorido através do processo fermentativo submerso utilizando a bactéria Ralstonia solanacearum cepa RS;
 Caracterizar os filmes coloridos de P(3HB) quanto à coloração macro e microestrtutural, resistência à fotodegradação e degradação térmica e fixação dos corantes;
 Formular um produto cosmético glitter biodegradável utilizando o P(3HB) colorido por processo de fermentação submersa e pó de mica.
 Contribuir com a pesquisa e inovação cientifica e tecnológica para o atingimento dos objetivos do desenvolvimento sustentável.
O produto final a ser obtido é um processo de obtenção do bioplástico P(3HB) sintetizado pela bactéria Ralstonia solanacearum cepa RS colorido durante a síntese do biopolimero no desenvolvimento da fermentação submersa. Desse modo, o presente projeto visa obter um novo processo de obtenção de bioplástico biodegradável colorido, um produto final glitter biodegradável aplicando o bioplástico colorido obtido via fermentação, uma tese de doutorado sobre o processo de produção do bioplástico colorido via fermentação submersa, uma patente de invenção sobre o processo de produção do bioplástico colorido via fermentação submersa, pelo menos um artigo científico sobre o processo de produção do bioplástico colorido via fermentação submersa e divulgação dos resultados em congressos científicos
Os polímeros biodegradáveis se mostram como um campo promissor, que tem seu desenvolvimento acompanhado de tendências ambientais necessárias para sobrevivência e conservação da biodiversidade geral. Sua utilização é crescente, para embalagens, bem como para os mais variados setores, sendo uma área de grande potencial de estudos (Falcone et al., 2007).
Um dos polímeros biodegradáveis mais estudos atualmente é o poli(3-hidroxibutirato) [P(3HB)], um polímero bacteriano da classe dos polihidroxialcanoatos que possui características físicas similares ao polipropileno, tais como: termoplasticidade, cristalinidade e tensão de cisalhamento , além disso, possui características atrativas ao âmbito ecológico, sendo biocompatível e possuindo uma degradabilidade, em um ambiente microbiologicamente ativo, superior aos plásticos convencionais (Weng et al., 2013).
A obtenção de filmes coloridos do bioplástico P(3HB) durante o processo fermentativo diminui as etapas do processo de coloração deste bioplástico, gerando um ganho econômico e ambiental durante o processamento. Além disso, a utilização de bioplástico biodegradável diminui consideravelmente os riscos para os ecossistemas naturais que podem ser causados quando da utilização de plásticos petroquímicos. Tal pesquisa ainda não consta na literatura atual, torna o projeto inovador e com potencial de aplicação na indústria brasileira.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
CAMILA RIOS PIECHA
CAROLINE DE PAULA LOPES CORREA8
CRISTIANE WIENKE RAUBACH3
Ketnen Rieffel das Chagas
LUCIANA BICCA DODE6
MARIA LUIZA DE OLIVEIRA ZANINI
MARIA TERESA BICCA DODE
PATRÍCIA SILVA DIAZ9

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