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As doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) representam a principal causa de morte no mundo e, no Brasil, correspondem a 70% das causas de morte (Malta; Moura; Prado; Escalante et al., 2014). Inclusive, as doenças cardiovasculares (DCV’s) são responsáveis por um 28% dos óbitos em adultos (Malta; Moura; Prado; Escalante et al., 2014). Diversas teorias já foram propostas para explicar o processo de envelhecimento. Sendo o mais aceito é que o envelhecimento resulta de um acúmulo de danos celulares. Estes danos celulares são derivados de diversas injurias sofridas pelo organismo ao longo da vida, incluindo instabilidade genômica, diminuição dos telomeros, alterações epigenéticas e perda da proteostase (Lopez-otin; Blasco; Partridge; Serrano et al., 2013). Como resposta a este dano, o organismo inicia uma série de adaptações antagonisticas como a desregulação na sensibilidade a nutrientes, disfunção mitocondrial e senescência celular (Lopez-otin; Blasco; Partridge; Serrano et al., 2013). Assim o risco de ocorrência de doenças crônicas como diabetes tipo II, DCV, câncer, entre outros, aumenta dramaticamente com o envelhecimento da população e tem se tornado um problema econômico grave em diversos países.
Somado a estes fatores, o envelhecimento na mulher é caracterizado pela ocorrência da menopausa. A menopausa é definida como a cessação da ovulação devido ao esgotamento da reserva folicular ovariana, que ocorre por volta dos 50 anos de idade, e é caracterizada pela ausência de ciclos menstruais por pelo menos doze meses em mulheres mais velhas (Te velde; Scheffer; Dorland; Broekmans et al., 1998). Como resultado da inatividade ovariana, os níveis de estrogênio e inibina são severamente reduzidos em mulheres na pós-menopausa (Te velde; Scheffer; Dorland; Broekmans et al., 1998). Essas deficiências hormonais levam a alterações no perfil lipídico sérico, bem como na composição corporal e distribuição de gordura (Carr, 2003; Kim; Kim; Ryu; Ryoo, 2000; Stevenson; Crook; Godsland, 1993). Portanto, o início da menopausa está associado a diversas alterações fisiológicas e bioquímicas, resultando em aumento da suscetibilidade a doenças crônicas como diabetes tipo 2 (Carr, 2003) e DCV (Wellons; Ouyang; Schreiner; Herrington et al., 2012). A ocorrência de DCV em mulheres na pré-menopausa é menor do que em homens da mesma idade, porém aumenta nas mulheres na pós-menopausa a níveis comparáveis aos homens (Sutton-tyrrell; Lassila; Meilahn; Bunker et al., 1998). Portanto, é importante compreender as alterações fisiológicas e bioquímicas associadas à menopausa para prevenir a incidência de doenças crônicas neste grupo de alto risco.
Desta maneira é interessante destacar que a idade a menopausa tem uma relação direta com a longevidade. Mulheres com menopausa precoce tem menor expectativa de vida, considerando mortalidade por diversas causas (Jacobsen; Knutsen; Fraser, 1999). Especificamente mulheres com menopausa precoce tem maior risco de morte por DCV (Jacobsen; Knutsen; Fraser, 1999). Isso sugere que o ovário pode influenciar ativamente a saúde geral da mulher. Em camundongos foi observado que o transplante de ovários jovens para fêmeas mais velhas aumentou a expectativa de vida das fêmeas mais velhas (Mason; Cargill; Anderson; Carey, 2009). Além disso, estudos mais recentes demonstraram que o transplante de ovários jovens com depleção de células germinativas aumentou ainda mais a expectativa de vida das fêmeas receptoras (Habermehl; Parkinson; Hubbard; Ikeno et al., 2019), levantando a questão de quais células ovarianas ou fatores são responsáveis por este efeito protetor. Curiosamente, independentemente da presença de células germinativas, as alterações de citocinas inflamatórias associadas ao envelhecimento foram revertidas após quatro meses de exposição ao ovário jovem (Habermehl; Parkinson; Hubbard; Ikeno et al., 2019). Então estas evidências nos sugerem que o ovário jovem produz fatores intrínsecos que são capazes de prevenir o envelhecimento e, portanto, podem ter um efeito protetivo contra diversas doenças crônicas.
Neste sentido exossomos são vesículas extracelulares nanométricas, conhecidas por circularem pela corrente sanguínea para transferir sinais moleculares de tecido para tecido. Essas estruturas esféricas são cercadas por uma bicamada lipídica, carregam uma carga biológica ativa como proteínas, lipídios, carboidratos e material genético. O conteúdo dos exossomos é afetado por sua origem e também, supostamente, devido à condição fisiológica da célula secretora. Estudos recentes têm demonstrado que as mensagens, veiculadas pelos RNAs exossômicos secretados, podem gerar alterações na expressão gênica e nas concentrações de proteínas das células receptoras, sugerindo a funcionalidade do conteúdo do exossomos nas células-alvo (D'anca; Fenoglio; Serpente; Arosio et al., 2019). Ainda, interessantemente estudos demonstram que a injeção de exossomos de animais jovens em animais velhos tem o efeito de reduzir e retardar os efeitos do envelhecimento (Lee; Kim; Choi; Cho et al., 2018). Desta maneira, nosso projeto visa entender se os exossomos presentes em fêmas com ovário intacto também tem efeitos de redução do envelhecimento em fêmeas em menopausa induzida de mesma idade.

Os animais serão fornecidos pelo Biotério da Universidade Federal de Pelotas (UFPel) e mantidos no Laboratório Experimental da Faculdade de Nutrição da UFPel. Serão utilizadas 195 fêmeas da linhagem C57BL/6, 45 serão mantidas em caixas com as seguintes características: medidas 65x25x15 cm, feita de prolipropileno com tampa em arame galvanizado, com bebedouro em prolipropileno com capacidade de 700 mL, rolha cônica de borracha e bico de aço inoxidável reto. O assoalho será coberto por maravalha. Serão alojadas quatro fêmeas por caixa. O ambiente terá temperatura e umidade controladas em 22-24°C e 40-60%, respectivamente, e ciclo de claro/escuro de 12 horas. Todos os animais receberão ração e água ad-libitum.
- Manejo dos animais:
Os animais serão divididos em 3 grupos de 15 animais cada, sendo: Grupo Controle (n=15) que não receberão VCD nem exossomos, Grupo VCD (n=15) que receberão VCD para induzir menopausa e não receberão exossomos e Grupo VCD + Exossomos (n=15) que receberão VCD para induzir menopausa e reposição de exossomos.
Para conseguir efetuar as injeções de exosomos nas dosagens propostas precisamos de 150 animais controle, pois todo o exossomo extraídos do soro de um camundongo será usado para injetar outro camundongo em menopausa em um momento, conforme Lee et al., (2018). Ou seja, 1 injeção a cada 3 dias totalizando 10 dias = 10 doses/animal x 15 animais no grupo VCD + exossomos = 150 doses de exossomos. Para tal o soro de todos os 150 camundongos será unido em tubo falcon e misturado para extração e preparação das frações individuais de 100 uL/camundongo tratado.
- Eutanásia e coleta de tecidos:
Será realizada eutanásia dos animais, após jejum de 4 horas, os animais serão anestesiados por via inalatória com isofluorano, para que após seja realizada a exsanguinação por punção cardíaca, seguida de deslocamento cervical. O procedimento será realizado em sala específica e isolada, localizada anexa ao local onde os animais foram mantidos. Os camundongos serão dissecados e dos animais aos 6 meses de vida, 1 mês após início dos tratamentos, e, coletados ovários, gordura, fígado e soro. Nos ovários coletados será feita a quantificação do número de folículos primordiais, primários, secundários e terciários conforme metodologia padronizada em nosso laboratório. Também será medido o colesterol, acúmulo de gordura visceral e periovariana, e marcadores de senescência, visto que já existem dados fortemente assegurados na literatura que comprovam a predisposição de doenças na pós-menopausa como, doença cardíaca, desregulação dos níveis de glicose e acúmulo de gordura visceral (Broekmans et al., 2009).
- Substâncias utilizadas e dosagens:
Diepóxido de 4-vinicilciclohexeno será administrado via intraperitoneal, diariamente durante 15 dias a partir dos 60 dias de idade. Dose 160mg/kg.
Exossomos serão administrados via intraperitoneal, 1 injeção à cada 3 dias durante 30 dias. Dose 100uL/animal/aplicação (proporcional ao extraído do soro de um animal controle) (Lee et al., 2018).
Insulina será administrada via intraperitoneal, 1 vez aos 6 meses de idade. Dose 0.5 U/kg.
D-Glucose será administrada via intraperitoneal, 1 vez aos 6 meses de idade. Dose 2g/kg.
- Teste de Tolerância à Insulina e Glicose:
O Teste de Tolerância à Insulina (TTI) será feito pela administração da dose de 0,5 UI/kg de peso corporal de insulina intraperitoneal após duas horas de jejum, o sangue para a testagem será coletado através de uma pequena incisão na ponta da cauda nos seguintes tempos: 0, 5, 20 e 35 minutos após a injeção de insulina e os níveis de glicose serão mensurados com um glicosímetro (AccuChek Activ, Roche Diagnostics®, USA) (FANG et al., 2013). Serão usados 6 animais por grupo. O Teste de Tolerância à Glicose (TTG) será utilizado para avaliar o metabolismo da glicose. Será administrado 2 g de glicose/kg de peso corporal por via intraperitoneal após 4 h de jejum. O sangue será coletado através de uma pequena incisão na ponta da cauda nos seguintes tempos 0, 15, 30, 60 e 120 minutos após a injeção de insulina e os níveis de glicose serão mensurados com um glicosímetro (BENNIS et al., 2017). Serão usados 6 animais por grupo.

Espera-se compreender os mecanismos reguladores e as moléculas envolvidas subjacentes ao envelhecimento, com interesse em prevenir ou retardar o envelhecimento ou doenças associadas em fêmeas após a menopausa. Este trabalho será pioneiro em demonstrar a associação dos exossomos circulantes com os efeitos negativos da menopausa, poderá trazer novos dados a respeito de intervenções precoces na preservação da fertilidade.
Acreditamos que esta linha de estudo tem bastante potencial, pois poucos trabalhos são produzidos tendo como enfoque a saúde e fertilidade da fêmea durante o envelhecimento. Esta temática é cada vez mais importante, visto que a expectativa de vida da população vem aumentando nos últimos anos e com isso a incidência de diversos tipos de enfermidades ligadas a idade como câncer, diabetes e doenças cardiovasculares. Estas doenças são particularmente importantes em mulheres peri e pós-menopausa, quando sua incidência aumenta drasticamente. Estes aspectos têm sido explorados em pesquisas clínica com seres humanos de maneira inicial pelo nosso grupo também, por isso torna-se importante a confirmação de hipóteses em camundongos para guiar os estudos com seres humanos.
Esperamos publicar dois artigos científicos em revista internacional com base neste projeto.