Nome do Projeto
Análise do potencial vacinal de BCG recombinante expressando antígenos de Trypanosoma cruzi contra doença de Chagas
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
31/03/2022 - 31/03/2026
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
A doença de Chagas (DC) é uma zoonose causada pela infecção do hemoparasita Trypanosoma cruzi em seres humanos. A doença é endêmica no continente americano e afeta mais de 7 milhões de pessoas mundialmente, sendo considerada uma parasitose de alto risco (WHO, 2021), com cerca de 200.000 novos casos e 12.500 óbitos anualmente. Após a fase aguda, da doença de chagas as pessoas entram em uma fase crônica, que pode durar anos ou décadas. A forma cardíaca é a manifestação mais grave e frequente da doença de Chagas crônica, desenvolve-se em 20% a 30% dos indivíduos infectados e geralmente leva a insuficiência cardíaca, tromboembolismo e morte súbita. Apesar de vacinas desenvolvidas e avaliadas em estágio pré-clínico, como vacinas recombinantes, de subunidade ou de DNA dada a complexidade da infecção, ainda não há uma vacina eficaz no tratamento ou imunização à doença. Tal complexidade se dá pelo ciclo de vida do parasita. Diversas proteínas podem apresentar potencial na sua utilização como antígenos para o desenvolvimento de vacinas recombinantes no combate a DC. Proteínas consideradas fatores de virulência do T. cruzi, como a cruzipain, trans-sialidase, Tc24, TcG2 e TSA-1, foram utilizadas como antígenos em diferentes formulações vacinais, na tentativa de obter uma vacina. Dentre os antígenos já descritos, Tc24 (Flagellar calcium-binding 24 kDa protein) e TSA-1 (Trypomastigote surface antigen/glycoprotein 1), proteínas expressas na fase tripomastigota do parasita, apresentaram evidências como vacina terapêutica. Mesmo proteínas oriundas da fase amastigota do patógeno, como o ASP-2 (Amastigote surface protein 2), são capazes de conferir proteção a linhagem de camundongos altamente suscetível a infecção, quando confeccionados em vacina, O uso da plataforma BCG (Bacillus Calmette-Guerin) como vetor para extrair o potencial vacinal desses antígenos contra T. cruzi foi explorado recentemente. BCG como um adjuvante tem a capacidade de fornecer imunidade contra microrganismos intracelulares, além disso, BCG direciona uma resposta tipo Th1 contra antígenos relacionados ou não ao microrganismo. Esse perfil de resposta imune é crítico para o controle da infecção por T. cruzi. Além das vantagens específicas no auxílio ao combate contra a parasitose, o uso de BCG na vacinação oferece outros benefícios. Por ser um sistema vacinal estudado desde 1921 e empregado mundialmente em larga escala contra a tuberculose desde 1948, atualmente, trata-se de uma vacina de baixo custo e são diversos os estudos que comprovam sua alta estabilidade e segurança na aplicação. Dessa forma, o presente projeto visa a avaliação do potencial imunológico e imunoprotetor de M. bovis BCG expressando antígenos de T. cruzi, como, os genes asp-2, tsa-1 e tc24 em camundongos. O desenvolvimento deste projeto possibilitará um grande avanço na busca de novas estratégias para o controle de umas das mais importantes doenças tropicais negligenciadas, através de resultados inéditos nas pesquisas, bem como o desenvolvimento de novos produtos na área de biotecnologia
Objetivo Geral
Desenvolvimento de vacina recombinante contra doença de Chagas utilizando BCG recombinante expressando antígenos de T. cruzi.
Justificativa
A doença de Chagas (DC), causada por infecção humana do parasita hemoflagelado Trypanosoma cruzi, afeta mais de 7 milhões de pessoas em todo o mundo, sendo uma das mais expressivas doenças tropicais negligenciadas no mundo e uma das principais causas da pobreza na América Latina, resultando em perdas de US$ 1,2 bilhão na economia anualmente (HOTEZ et al., 2008; DUMONTEIL et al., 2012). Estima-se que do total de pessoas infectadas com T. cruzi em todo o mundo, mais de 99% dos casos ocorrem na América Latina, especialmente nos países mais pobres da região (HOTEZ et al., 2013). Com base nos disability-adjusted life-years (DALYs) a carga somática da doença de Chagas é cinco vezes maior que da malária, e é aproximadamente um quinto do HIV/AIDS na América Latina e Caribe (HOTEZ et al., 2008).
Apesar dos impactos socioeconômicos gerados pela DC, nenhuma vacina é disponível para controlar a infecção humana por T. cruzi, entretanto, diferentes candidatos a vacinas pré-clínicas com base em sistemas de distribuição bacteriana, subunidades virais, de DNA ou de proteínas com adjuvantes foram desenvolvidos e avaliados (BIVONA et al., 2020). Além disso, muitas dessas vacinas permitem o desenvolvimento de uma resposta imune que resulta em até 100% de sobrevivência em modelos de infecção de camundongos desafiados com doses letais de T cruzi (LUHRS et al., 2003; ARAÚJO et al., 2005; FONTANELLA et al., 2008).
Embora existam vacinas em desenvolvimento, com boa efetividade em estágio pré-clínico, até o presente momento, não há, de fato, uma vacina funcional e aplicável. Desta forma, o desenvolvimento de alternativas para a profilaxia da DC é fundamental para a melhoria na qualidade de vida de indivíduos potencialmente em risco ou já acometidos. Com o uso de uma vacina recombinante baseada em BCG espera-se um incremento na resposta imune e elevada taxa de sobrevida dos animais experimentais a fim de evidenciar o potencial dessa vacina recombinante para o controle da doença de Chagas.
A realização deste projeto possibilitará um grande avanço na busca de novas estratégias, produtos e alternativas, para o controle de uma das mais graves doenças tropicais negligenciadas, atenuando impactos socioeconômicos nas regiões afetadas.
Apesar dos impactos socioeconômicos gerados pela DC, nenhuma vacina é disponível para controlar a infecção humana por T. cruzi, entretanto, diferentes candidatos a vacinas pré-clínicas com base em sistemas de distribuição bacteriana, subunidades virais, de DNA ou de proteínas com adjuvantes foram desenvolvidos e avaliados (BIVONA et al., 2020). Além disso, muitas dessas vacinas permitem o desenvolvimento de uma resposta imune que resulta em até 100% de sobrevivência em modelos de infecção de camundongos desafiados com doses letais de T cruzi (LUHRS et al., 2003; ARAÚJO et al., 2005; FONTANELLA et al., 2008).
Embora existam vacinas em desenvolvimento, com boa efetividade em estágio pré-clínico, até o presente momento, não há, de fato, uma vacina funcional e aplicável. Desta forma, o desenvolvimento de alternativas para a profilaxia da DC é fundamental para a melhoria na qualidade de vida de indivíduos potencialmente em risco ou já acometidos. Com o uso de uma vacina recombinante baseada em BCG espera-se um incremento na resposta imune e elevada taxa de sobrevida dos animais experimentais a fim de evidenciar o potencial dessa vacina recombinante para o controle da doença de Chagas.
A realização deste projeto possibilitará um grande avanço na busca de novas estratégias, produtos e alternativas, para o controle de uma das mais graves doenças tropicais negligenciadas, atenuando impactos socioeconômicos nas regiões afetadas.
Metodologia
Expressão e purificação das proteínas rASP-2, rTSA-1, rPFR e rTc24: Os genes asp-2, tsa-1, paf e tc24 de T.cruzi serão sintetizados pela empresa Genome, e após subclonados no vetor de expressão em E. coli pAE (Ramos et al., 2004).A expressão das proteínas rASP-2, rTSA-1, rPFR e rTc24 será realizada nas cepas de E. coli BL21. A purificação será realizada por cromatografia de afinidade ao níquel em coluna de sepharose (HisTrap).
Produção de soro policlonal As proteínas purificadas recombinantes purificadas (rASP-2, rTSA-1, rPFR e rTc24) serão utilizadas para imunização de camundongos para produção de soro policlonal.
Construção de BCG expressando as proteínas rASP-2, rTSA-1, rPFR e rTc24 de T. cruzi:Os genes sintéticos asp-2, tsa-1, paf e tc24 serão ligados nos vetores de expressão em M. bovis BCG (pUS2000 e pUS977) (Dellagostin ET al., 1993). A avaliação de BCG recombinante expressando as proteínas será realizada por western blot utilizando soro policlonal. Imunização de camundongos com BCG recombinante M. bovis BCG recombinante expressando as proteínas rASP-2, rTSA-1, rPFR e rTc24 será utilizado na inoculação de camundongos BALB/c fêmeas com 6 a 8 semanas de idade.
Avaliação da resposta imune: O título de anticorpos sistêmicos IgG específicos para as proteínas recombinantes será determinado através de um ELISA indireto utilizando como antígeno as proteínas recombinantes purificadas (rASP-2, rTSA-1, rPFR e rTc24). A resposta imune celular será avaliada pela quantificação de mRNA das principais citocinas.
Avaliação Histopatológica: Corações dos camundongos imunizados e infectados com T. cruzi serão removidos no dia 180 pós-imunização. Corações de camundongos serão fixados em formalina tamponada e incluídos em parafina. Cortes (5 µm) serão corados com hematoxilina e eosina para avaliação do parasitismo tecidual e das lesões cardíacas
Produção de soro policlonal As proteínas purificadas recombinantes purificadas (rASP-2, rTSA-1, rPFR e rTc24) serão utilizadas para imunização de camundongos para produção de soro policlonal.
Construção de BCG expressando as proteínas rASP-2, rTSA-1, rPFR e rTc24 de T. cruzi:Os genes sintéticos asp-2, tsa-1, paf e tc24 serão ligados nos vetores de expressão em M. bovis BCG (pUS2000 e pUS977) (Dellagostin ET al., 1993). A avaliação de BCG recombinante expressando as proteínas será realizada por western blot utilizando soro policlonal. Imunização de camundongos com BCG recombinante M. bovis BCG recombinante expressando as proteínas rASP-2, rTSA-1, rPFR e rTc24 será utilizado na inoculação de camundongos BALB/c fêmeas com 6 a 8 semanas de idade.
Avaliação da resposta imune: O título de anticorpos sistêmicos IgG específicos para as proteínas recombinantes será determinado através de um ELISA indireto utilizando como antígeno as proteínas recombinantes purificadas (rASP-2, rTSA-1, rPFR e rTc24). A resposta imune celular será avaliada pela quantificação de mRNA das principais citocinas.
Avaliação Histopatológica: Corações dos camundongos imunizados e infectados com T. cruzi serão removidos no dia 180 pós-imunização. Corações de camundongos serão fixados em formalina tamponada e incluídos em parafina. Cortes (5 µm) serão corados com hematoxilina e eosina para avaliação do parasitismo tecidual e das lesões cardíacas
Indicadores, Metas e Resultados
Embora existam vacinas em desenvolvimento em estágio pré-clínico, até o
presente momento, não há, de fato, uma vacina funcional e aplicável. Desta forma, o
desenvolvimento de alternativas para a profilaxia da Doença de Chagas é fundamental
para a melhoria na qualidade de vida de indivíduos potencialmente em risco ou já
acometidos. Antígenos já identificados estão sendo testados em diferentes sistemas,
com variados graus de proteção conferida. Com o uso de uma vacina recombinante
baseada em BCG espera-se um incremento na resposta imune e elevada taxa de
sobrevida dos animais experimentais a fim de evidenciar o potencial dessa vacina
recombinante para o controle da doença de Chagas, e tuberculose, sendo uma vacina
bivalente. A realização deste projeto possibilitará um grande avanço na busca de
novas estratégias, produtos e alternativas, para o controle de uma das mais graves
doenças tropicais negligenciadas, atenuando impactos socioeconômicos nas regiões
afetadas.
Espera-se gerar de 2 a 4 artigos científicos que possam ser veiculados em
periódicos de circulação internacional. O projeto possibilitará, ainda, a divulgação dos
resultados em congressos científicos (Congressos de Iniciação Científica, de
Microbiologia, de Genética e de Imunologia). Há ainda a expectativa de obtenção de
um produto tecnológico o qual deverá ser protegido através patente. Além disso,
fortalecerá as colaborações regionais, nacionais e internacionais já estabelecidas.
presente momento, não há, de fato, uma vacina funcional e aplicável. Desta forma, o
desenvolvimento de alternativas para a profilaxia da Doença de Chagas é fundamental
para a melhoria na qualidade de vida de indivíduos potencialmente em risco ou já
acometidos. Antígenos já identificados estão sendo testados em diferentes sistemas,
com variados graus de proteção conferida. Com o uso de uma vacina recombinante
baseada em BCG espera-se um incremento na resposta imune e elevada taxa de
sobrevida dos animais experimentais a fim de evidenciar o potencial dessa vacina
recombinante para o controle da doença de Chagas, e tuberculose, sendo uma vacina
bivalente. A realização deste projeto possibilitará um grande avanço na busca de
novas estratégias, produtos e alternativas, para o controle de uma das mais graves
doenças tropicais negligenciadas, atenuando impactos socioeconômicos nas regiões
afetadas.
Espera-se gerar de 2 a 4 artigos científicos que possam ser veiculados em
periódicos de circulação internacional. O projeto possibilitará, ainda, a divulgação dos
resultados em congressos científicos (Congressos de Iniciação Científica, de
Microbiologia, de Genética e de Imunologia). Há ainda a expectativa de obtenção de
um produto tecnológico o qual deverá ser protegido através patente. Além disso,
fortalecerá as colaborações regionais, nacionais e internacionais já estabelecidas.
Equipe do Projeto
| Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
|---|---|---|---|
| BÁRBARA DA ROCHA FONSECA | |||
| BÁRBARA DA ROCHA FONSECA | |||
| GUILHERME SENNA DOS SANTOS | |||
| GUSTAVO DOS SANTOS HARTLEBEN | |||
| ODIR ANTONIO DELLAGOSTIN | 2 | ||
| RODRIGO ALBERTHO ALMEIDA WEDY | |||
| SIBELE BORSUK | 4 |
Fontes Financiadoras
| Sigla / Nome | Valor | Administrador |
|---|---|---|
| FAPERGS / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado Rio Grande do Sul | R$ 31.150,00 | Coordenador |
Plano de Aplicação de Despesas
| Descrição | Valor |
|---|---|
| 339030 - Material de Consumo | R$ 31.150,00 |