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Os protozoários são importantes causadores de doenças em seres humanos e animais, provocando grandes perdas econômicas e afetando o bem-estar. A tricomoníase humana, é uma IST não viral, que muitas vezes passa despercebida e afeta principalmente mulheres, causando sérios quadros de vaginite aguda. Os fármacos utilizados na prevenção dessa enfermidade e uso de doses subterapêuticas, acarretam na resistência ao medicamento ou promovem a toxicidade, uma vez que, o fármaco é administrado incorretamente, predispõe a cepas resistentes do parasito. Considerando a capacidade dos derivados oxadiazóis em liberar óxido nítrico, molécula com atividade antiprotozoária, capaz de interferir diretamente no metabolismo do parasito, torna-se importante a pesquisa de novos fármacos derivados dos oxadiazóis, a fim de buscar tratamento alternativo, com pouco ou nenhum efeito colateral e que seja capaz de combater as doenças. Sendo assim, os derivados 1,2,5-oxadiazóis podem desempenhar importante papel no controle destas enfermidades.

Derivados dos benzofuroxanos

Os compostos testados no presente experimento serão sintetizados e cedidos pelo LabSelen-NanoBio (UFSM), laboratório que atuará em parceria neste trabalho. O quadro a seguir mostra os compostos que serão testados: EA2, EH1, EH2 e EH3.
Teste citotóxico e genotóxico
Para avaliação da citotoxicidade, a fim de avaliar os efeitos de danos dos derivados benzofuroxanos sobre a viabilidade celular (células VERO), assim como seus efeitos sobre os cromossomas de linfócitos humanos (células mononucleares), será realizado o Teste Ensaio de MTT. Para avaliação da genotoxicidade serão utilizados o Teste cometa alcalino, o qual quantifica as lesões e detecta os efeitos do reparo no DNA em células individualizadas de mamíferos. E o Teste de frequência de micronúcleos, o qual, avalia alterações cromossômicas.
Parasito
As amostras de T. vaginalis utilizadas neste projeto serão utilizadas de cultivos já existentes no Laboratório de Protozoologia e Entomologia (LAPEn) provenientes de isolados clínicos. O parasito será mantido em cultura in vitro, preparada por imersão de swabs vaginias em meio de cultivo específico (TYM). As culturas serão observadas diariamente para verificar o crescimento e replicadas para novos tubos de cultivos durante o período experimental.
Ensaio in vitro

Para examinar a susceptibilidade de T. vaginalis aos derivados benzofuroxanos, serão utilizadas placas estéreis para cultivo de células, de 24 poços. Os trofozoítos serão incubados com as concentrações de cada composto 0,25%, 0,50% e 1%, sendo que para controle positivo será utilizado o metronidazol (100 μg). Para cada poço será adicionado um volume de 100 μL de meio de cultura (TYM), contendo 1x 104 parasitos pipetados, bem como, os compostos, nas concentrações apontadas e o metronidazol nas concentrações de 05, 1,0, 1,5% mL como controle. Além disso, será utilizado DMSO 4% para diluição do composto. Nos grupos controle serão utilizados o DMSO 4% e o meio com parasitos. Todos os ensaios serão realizados em triplicata. As placas serão incubadas a 37ºC em estufa contendo 5% de CO2. Os poços serão examinados com um microscópio invertido, a cada 24h, durante três dias consecutivos. A porcentagem de inibição de crescimento (GI%) será calculada por Seddiek et al., 2014.

Análise da expressão gênica de T. vaginalis
O RNA de T. vaginalis será isolado usando o kit Trizol Reagent (In vitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Para síntese de cDNA da primeira fita será realizado a partir de mRNA catalisado pela enzima transcriptase reversa (kit de transcrição reversa de cDNA). Para amplificação e quantificação de ácidos nucleicos será utilizado o MasterMIx Real Time PCR-SYBR Green contendo 20µl de mistura de PCR com 13µl SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosustems),300 nm de primers, 1µl de cDNA e água livre de RNase-DNase. Essa mistura será submetida a 95ºC por 5min seguido de 40 ciclos de 10 segundos a 95°C e 30 segundos a 60°C. A análise da curva de fusão será avaliada em 95 ° C por 15 s, 55 ° C por 15s e 95 ° C por 15 s. Os primers utilizados para a realização do PCR em tempo real são específicos para proteínas quinases e peptidases (cisteína peptidase), genes responsáveis pela adesão, citotoxicidade e metabolismo do parasito (SENA-LOPES et al., 2019).

Docking molecular
Uma análise in silico para predizer a melhor orientação de ajuste de um ligante em uma proteína, será realizado o docking molecular o qual nos permite caracterizar o comportamento dos compostos derivados dos benzofuroxanos utilizados no sítio de ligação das proteínas do grupo tiol e assim elucidar interações moleculares. A técnica utilizada será, de acordo com Alves e colaboradores, 2020.

Análises estatísticas

Os dados serão submetidos ao teste de normalidade, posteriormente será escolhido o teste estatístico. Se os dados apresentaram distribuição normal, serão usados para a análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste de Tukey (ρ≤0,05). Caso os dados não apresentem distribuição normal, estes poderão ser transformados ou avaliados com a análise de dados não paramétricos.

Resultados esperados
Espera-se que os compostos derivados dos benzofuroxanos sejam eficazes no controle da tricomoníase. A partir do estudo proposto, tem-se a intenção de desenvolver novas alternativas no tratamento da tricomoníase. O projeto procura buscar a otimização da ação dos fármacos através de novos compostos para uma futura inserção do produto no mercado brasileiro, como inovação tecnológica. Este composto pode representar uma possível alternativa, com maior potencial de eficácia em relação ao tratamento convencional.
Além disso, este estudo poderá gerar a publicação de artigos em revista de circulação internacional, classificadas como “A” no “Sistema de Classificação de Periódicos, Anais e Revistas” da CAPES. Também deverá ocorrer a divulgação dos resultados, em congressos da área em âmbito nacional e internacional e fará parte de um projeto de doutorado do Programa de Pós-graduação em Parasitologia da UFPel.