Nome do Projeto
AVALIAÇÃO DAS RESPOSTAS MORFOLÓGICAS E DE MARCADORES BIOQUÍMICOS EM MODELO DE CULTURA DE NEURÔNIOS DE RATOS WISTAR EXPOSTOS AO MP2.5
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
30/05/2022 - 30/05/2026
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
A exposição aos materiais particulados (MPs) encontrados na atmosfera, representa riscos à saúde e, com o aumento da poluição do ar, observa-se também um incremento na concentração destas substâncias o que impacta negativamente a qualidade de vida dos indivíduos. Os MPs são constituídos por partículas sólidas e líquidas de diversas granulometrias, formas e composição química que variam de acordo com sua origem e fonte, podendo ser naturais ou resultar de reações químicas atmosféricas. Os sistemas primariamente afetados pelo material particulado são os sistemas respiratório e cardiovascular, entretanto o sistema nervoso também se constitui em um importante alvo da ação deletéria dos MPs presentes na atmosfera. Estudos em humanos e em modelos animal, respectivamente, tem indicado que a poluição ambiental afeta o SNC contribuindo com o desenvolvimento das enfermidades neurodegenerativas, onde os MP’s alcançam o tecido nervoso por meio das vias circulatória e olfatória, gerando a resposta inflamatória e ativação de vias de sinalização relacionadas a inflamação e do estresse oxidativo . Além disso, as MPs associam-se com inúmeras proteínas e moléculas, tais como BDNF, mTOR, IL-6, IL-10, TNFalfa, parâmetros morfológicos e de estresse oxidativo. Desta forma, o estudo dos mecanismos pelos quais os MPs interagem com o organismo produzindo alteração homeostática será muito importante. Sendo assim, o presente estudo tem como objetivo avaliar os efeitos à exposição ao material particulado (MP2,5) de cultura primária de neurônios de córtex cerebral de ratos Wistar e o comportamento das de ratas Wistar.e de suas ninhadas.

Objetivo Geral

O presente estudo tem por objetivo avaliar os efeitos à exposição ao material particulado (MP2,5) em cultura primária de neurônios de córtex cerebral de ratos de 15 dias de idade e no comportamento de matrizes Wistar expostas ao MP2.5 durante o período gestacional e lactação, para análise posterior das suas proles, visando entender a influência do material particulado em processos bioquímicos, morfológicos e fisiológicos.

Justificativa

Considerando a relevância em compreender o efeito causado pela exposição dos seres vivos ao MP, por meio interferência em processos bioquímicos e fisiológicos em especial no sistema nervoso central, este estudo se propõe a investigação da possibilidade da contaminação vertical (gestação e lactação).
A exposição ao MP durante o período embrionário/fetal pode ser um fator de interferência no desenvolvimento do sistema nervoso central dos filhotes, além disso, a manutenção da contaminação das mães lactentes incrementar a bioacumulação, vindo a se refletir nos processos comportamentais de ratos Wistar.
O aumento significativo de poluentes no ar atmosférico é uma condição que pode estar relacionada a etiologia de diversas patologias. Estudos têm sido conduzidos, a fim de, elucidar as bases bioquímicas, moleculares, genéticas, epigenéticas e morfológicas pelas quais o MP interfere na homeostasia.
A relação do sistema nervoso central com o ambiente externo, via trato olfatório, pode contribuir para o desenvolvimento de processos neurodegenerativos, resultando em uma redução das funções nervosas. Assim avaliar o comportamento dos animais expostos ao MP, contribui para a compreensão dos aspectos motores, de aprendizado e memória. A ampliação e aprofundamento do conhecimento sobre os efeitos do MP sobre o sistema nervoso central, poderão auxiliar no desenvolvimento de estratégias tecnológicas/terapêuticas capazes de minimizar diretamente os mecanismos patológicos.

Metodologia

Para a realização do presente estudo faz necessário o estabelecimento das condições experimentais ideais, tanto para os cultivos celulares quanto para a exposição das fêmeas prenhas, o caráter inovador das técnicas utilizadas para a obtenção dos resultados desejados implica no estabelecimento de protocolos ainda não descritos na literatura científica, salienta-se que os resultados obtidos nos experimentos piloto gerarão dados para a elaboração de trabalhos de conclusão de curso dos graduandos pertencentes ao grupo de pesquisa.
As amostras de MP2,5 utilizadas nos experimentos foram coletadas na área metropolitana da cidade do Rio de Janeiro, RJ, Brasil, pelo Instituto Estadual do Ambiente (INEA), durante o inverno (junho e julho) de 2012, quando altos níveis de MP2,5 ocorrem.
Em todos os protocolos piloto o material particulado utilizado seguirá a metodologia descrita por RIBEIRO et al. (2016). Uma curva concentração-resposta será obtida utilizando as soluções concentradas e três diluições 2,5x, 5x e 10x. Em nossos estudos será utilizada a via intranasal, a qual não sofre efeito de primeira passagem hepática.
Protocolo Experimental Piloto para o cultivo primário de neurônios do córtex dos ratos com 15 dias de idade: neste experimento serão utilizados 8 ratos Wistar com 15 dias de idade com o objetivo de estabelecer as condições ideais de cultivo celular. Após as células atingirem a confluência, serão expostas ao MP2,5 diariamente em diferentes tempos, 24h, 48h, 72h, 10dias e 15 dias consecutivos. Assim, fornecendo dados para a realização do Experimento 1, desta forma utilizando os animais de forma racional.
Delineamento Experimento 1: Este estudo tem caráter experimental no qual serão obtidas células de ratos Wistar (machos e fêmeas) com 15 dias de idade. Será retirado o córtex cerebral para o cultivo primário de neurônios. As células em cultura serão submetidas a uma exposição diária em diferentes tempos, 24h, 48h, 72h 10dias e 15 dias consecutivos. Sendo cinco grupos de tratamento e um grupo controle, cada grupo será composto por 8 animais, perfazendo um total de 6 grupos experimentais, com 4 repetições cada. As células serão avaliadas quanto aos efeitos tóxicos da exposição ao MP2,5 sobre os mecanismos morfológicos e bioquímicos. Os animais serão eutanasiados e os córtex cerebrais serão extraídos para realização das culturas de neurônios até as células atingirem confluência. Após serão expostas aos MPs. Os parâmetros bioquímicos, morfológicos e de imunofluorescência serão avaliados nas células controle e células tratadas com MP2,5 nos diferentes tempos de exposição. Para a imunofluorescência, as células serão semeadas em lamínulas e fixadas com formaldeído 10%. As análises morfológicas serão realizadas por meio de microscópio com captura de imagens.
Protocolo Experimental Piloto para a exposição das fêmeas prenhes ao MP2,5: este experimento tem por objetivo estabelecer as condições para exposição ao material particulado das fêmeas prenhes pela via intranasal, serão utilizadas 6 fêmeas para este fim, grupos de duas fêmeas receberam a instilação de 2,5, 5 e 10μl, respectivamente, de volume do material particulado diluído em solução salina. A via intranasal apresenta vantagens em relação a via mais comumente utilizada que é a via intraperitoneal, diminui o estresse de manuseio oriundo da administração injetável e também reduz a possibilidade de aborto pelas fêmeas e os possíveis danos aos embriões causados pela agulha. Esta via de administração tem sido descrita na literatura científica como uma excelente alternativa para a absorção de substâncias devido a rica vascularização, área de superfície grande e alta permeabilidade da membrana e ainda não sofre o efeito de primeira passagem hepática, e inúmeras substâncias administradas intranasalmente atingem o sistema nervoso em minutos através dos nervos olfatório e trigeminal (ALSARRA et al.; 2011; KAUR et al.; 2016; MUSTAFA et al.; 2016). Para a realização do experimento 2 faz-se necessário estabelecer as doses adequadas a serem administradas, para tanto este piloto irá possibilitar a construção de uma curva dose-resposta a ser utilizada no protocolo experimental 2.
Delineamento Experimento 2: Este estudo também tem caráter experimental no qual fêmeas prenhes (Wistar) serão expostas ao material particulado a partir do 5 dia da retirada do macho. Neste experimento, 30 fêmeas e suas proles serão divididas em dois grupos: grupo 1: 5 mães não expostas ao MP2,5 e grupo 2: 5 mães expostas ao MP2,5, com uma repetição para cada grupo. O grupo 1 compreenderão as ratas controle e o grupo 2 as ratas expostas por 21 dias (período do nascimento dos filhotes) consecutivos ao MP2,5. Após, os filhotes serão observados e avaliados quanto ao comportamento por estímulo doloroso, cognitivo e motor aos 30 dias (idade adulta). Os parâmetros bioquímicos serão analisados em soro do sangue coletado e em tecidos.
Protocolo Experimental Piloto para o cultivo celular de neuroblastomas da linhagem celular SH- SY5Y: neste experimento objetiva-se estabelecer as condições ideais de cultivo, onde as células atinjam crescimento e morfologia adequados para a exposição ao MP2,5, as células sofrerão exposições diárias em diferentes tempos, 24h, 48h, 72h, 10 e 15 dias consecutivos, fornecendo assim os dados para a realização do experimento 2, possibilitando assim a comparação entre ambas culturas, de neurônios de ratos e humanas.
Delineamento Experimento 3: A utilização de modelos in vitro favorecem os campos de estudo em neurobiologia e neurociências, a cultura celular demonstra ser uma plataforma eficiente para a caracterização da funcionalidade proteica e dos mecanismos moleculares relacionados ao fenômeno específico em estudo, auxiliando no entendimento das patologias (SHIPLEY et al., 2016). Neurônios humanos adultos para estudos de função e de intervenção ainda não estão disponíveis, para que se obtenha dados sobre ação do MP2,5 em neurônios humanos, utiliza-se linhagens celulares, entre elas
os neuroblastomas da linhagem celular SH-SY5Y, que quando tratados com meio adequado apresenta características muito similares aos neurônios, permitindo assim um comparativo entre o efeito do material particulado em neurônios de ratos e humanos (AGHOLME et al. 2010), enriquecendo assim os resultados do estudo.
LOCAL DA PESQUISA
Este projeto será desenvolvido no laboratório de cultivo celular do Instituto de Biologia, Departamento de Morfologia da Universidade Federal de Pelotas (UFPel) em colaboração com o Instituto de Ciências Biológicas, FURG, Rio Grande, RS.
ANIMAIS
Primeiramente, serão utilizados 5 ratos com 15 dias de idade para o protocolo experimental piloto para o cultivo primário de neurônios de córtex. Para o experimento 1 serão utilizados 240 animais com 15 dias de idade, sendo necessárias 30 matrizes com uma ninhada média de 8 filhotes por gestação. Para a exposição das fêmeas prenhes no protocolo experimental piloto, serão necessárias 6 fêmeas prenhas. No experimento 2 comportamental serão utilizadas 60 fêmeas prenhes e suas respectivas ninhadas, todos os animais serão providenciados pelo biotério central da UFPel. Os animais serão mantidos no biotério central, em caixas-moradia, confeccionadas em plexiglass, medindo 65 x 25 x 15 cm, com assoalho recoberto de maravalha. Serão colocados 5 animais por caixa com ciclo claro-escuro de 12 horas, em temperatura ambiente (22°C + 2°C) com livre acesso à água e ração. Serão realizados todos os procedimentos necessários para minimizar dor e desconforto. QUANTIFICAÇÃO PROTÉICA
As proteínas totais presente nas amostras serão dosadas utilizando o método de Lowry (1951) (11) modificado por Peterson (1977) (12). A concentração de proteínas das amostras será calculada com base em curva padrão de proteína conhecida (albumina sérica bovina).
AVALIAÇÃO COMPORTAMENTAL
As proles das fêmeas expostas ao material particulado no Experimento 3, serão avaliados aos 30 dias de idade, utilizando os testes comportamentais de Campo Aberto (Open Field) e o Teste do labirinto de Morris (Morris water maze).
TESTE DE CAMPO ABERTO (OPEN FIELD):
O teste do campo aberto (open-field) será utilizado para medir respostas comportamentais tais como a atividade motora, a hiperatividade e comportamentos exploratórios (TREMML et al., 1998). Para este espaço utiliza-se uma arena quadrangular (67 cm x 67cm) fechada, com iluminação homogênea, onde o animal é deixado durante cinco a dez minutos, enquanto o comportamento é observado. Os ratos tendem a evitar iluminação forte e espaços abertos, portanto o ambiente do teste funciona como um estímulo ansiogênico, permitindo a medição da atividade locomotora induzida pela ansiedade, assim como dos comportamentos exploratórios. A interpretação da atividade locomotora será centrada principalmente no medo e na exploração, pois ambos os comportamentos motivam a atividade do animal (MARKEL et al., 1989). Sendo assim, o campo aberto também pode ser utilizado, secundariamente, como uma medida de ansiedade (BELZUNG, 1999).
TESTE DO LABIRINTO DE MORRIS (MORRIS WATER MAZE):
Será utilizado para investigar a aprendizagem espacial e a memória em roedores (MORRIS, 1981). O labirinto de Morris tem também sido bastante utilizado para validar modelos de roedores de doenças neurodegenerativas e para avaliar possíveis terapêuticas (D’HOOGE & DE DEYN, 2001). O teste do labirinto de Morris consiste num modelo de navegação espacial no qual o animal nada para encontrar uma plataforma escondida, utilizando marcas visuais do ambiente em que decorre o teste. O reforço positivo para o rato é escapar da água. O teste é baseado no princípio de que os roedores são altamente motivados para escapar do ambiente aquático, pelo caminho mais rápido e curto (WENK, 1998).
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados serão apresentados como média + erro padrão da média e serão submetidos à análise de variância (ANOVA) de uma via seguido do teste Post Hoc de Tukey. Ser

Indicadores, Metas e Resultados

Este é um estudo inovador que busca solidificar uma linha de pesquisa interdisciplinar abordando aspectos morfológicos, moleculares e bioquímicos e comportamentais dos efeitos deletérios à exposição ao material particulado no sistema nervoso e suas relações com os processos degenerativos, inflamatórios e nociceptivos neuronais. Espera-se, que ao concluir este estudo, obter um melhor entendimento dos mecanismos envolvidos na influência do material particulado, ao qual os indivíduos são expostos, e suas implicações na saúde. Os resultados serão apresentados nos Salões de Iniciação Científica e eventos nacionais e Internacionais. Além disso, prevemos publicação em periódico internacional e os possíveis desdobramentos em nível de Mestrado e Doutorado, promovendo assim uma consolidação desta linha de pesquisa.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
ADRIANA GIODA
ADRIANA LOURENCO DA SILVA2
ANA PAULA DA SILVA FERREIRA
CAROLINA ROSA GIODA
CAROLINE CRESPO DA COSTA2
DIOVANA PADILHA BUENO
GIOVANA DUZZO GAMARO2
IZABEL CRISTINA CUSTODIO DE SOUZA8
JÚLIA HINSCHINCK
MARIANGELA HEPPE LOPES1
NICOLAS HARTER STIGGER
PRISCILA CENTENO CRESPO
RICARDO NETTO GOULART
SARA FERREIRA NUNES
THAINA LEITE PALUDETO

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