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A salinização dos solos é um dos principais fatores que afetam gravemente a produtividade agrícola mundial, e tem sido uma das grandes preocupações de produtores e pesquisadores, visto que a disponibilidade de terras cultiváveis está sofrendo redução de 1-2% ao ano e solos condenados por salinidade estão aumentando.
O estado de salinidade caracteriza-se pela presença de altas concentrações de
sais solúveis no solo, íons cátions como o Na+, Ca2+, Mg2+, K+ e também os íons
ânions como o Cl-, SO42-, HCO3-, CO32- e NO3-, responsáveis pela formação dos sais
mais prejudiciais às plantas, os cloretos, sulfatos de sódio e de magnésio devido a
sua alta solubilidade. No entanto, o NaCl por ser um sal bastante solúvel e
abundantemente liberado no solo, é o sal de maior foco nas pesquisas atualmente e,
seu excesso, é responsável por ocasionar sérios problemas na agricultura (MUNNS;
TESTER, 2008; CARMONA, 2011).
Com relação ao influxo de íons na planta, o Na+ entra nas células das
raízes de forma passiva, por meio de canais do tipo catiônicos não seletivos (NSCC), e também por meio de transportadores como os de potássio (K+), da família HKT. De forma geral, a água, íons e outras moléculas quando absorvidas pelas raízes podem atravessar por duas vias, a simplástica ou transmembranar, já que na via apoplástica a estria de Caspary impede a passagem destas moléculas. No entanto, essa travessia obedece o gradiente eletroquímico permitindo com que as plantas restrinjam a passagem de íons Na+ pela membrana e assim reduzindo o seu influxo nas células (TAIZ; ZEIGER, 2009).
Além das barreiras apoplásticas que podem bloquear o fluxo de sódio, o Ca2+ também é um importante aliado, que sob alta concentração nas células (aproximadamente 10 mM), reduz o influxo de Na+, diminuindo seu conteúdo em raízes e brotações, e desta forma, melhorando também a tolerância das plantas à salinidade (TESTER; DAVENPORT, 2003).
Por outro lado, dos mecanismos que regulam a tolerância das plantas à salinidade, o sequestro de sódio da região citosólica para vacuolar ou em outros tecidos e células, é
considerado o principal mecanismo que regula a tolerância das plantas à salinidade
(KEISHAM et al., 2018). Essa compartimentalização principalmente no vacúolo ocorre em condições onde a concentração de íons no citosol é bastante elevada, permitindo com que níveis tóxicos de Na+ no citosol, não sejam atingidos. No entanto, para que a
compartimentalização ocorra, carreadores do tipo antiporte Na+/H+, localizados na membrana plasmática e vacuolar, é quem transportará o sódio para os vacúolos, conduzidos contra um gradiente eletroquímico de prótons que são gerados por proteínas transportadoras como a H+-ATPase e a H+-PPase (APSE; BLUMWALD, 2007).
Diante disso, a remediação como estratégia para reduzir os níveis de sais nos solos, torna-se uma importante ferramenta na restauração ecológica e na melhoria das condições químicas e físicas destes solos, por meio da utilização de plantas extremamente tolerantes a ambientes salinos, chamadas plantas halófitas (QADIR; OSTER, 2004; JING et al., 2018).
Ao contrário das plantas glicófitas, que são extremamente sensíveis e
acabam morrendo quando expostas a altas concentrações de sais, e neste grupo inclui-se a maioria das plantas cultivadas, as plantas do grupo das halófitas conseguem se desenvolver e completar seu ciclo de vida em ambientes com altas concentrações de sais, apresentando diversas proteínas, genes, mecanismos e estruturas especializadas que respondem positivamente ao sal e desta forma neutralizam a ação negativa deste estresse, sendo estes sais em alguns casos, um importante aliado para que a espécie possa completar seu ciclo de vida com maior êxito (PLANTA et al., 2016; WU, 2018).
Dentre as principais estratégias adotadas pelas plantas halófitas para suportar
altas concentrações salinas estão: (1) a redução do influxo de sódio (Na+); (2) a
compartimentalização dos sais, com o sequestro de sódio da região citosólica para vacuolar ou em outros tecidos e células, melhorando o crescimento e desenvolvimento normal das plantas; (3) a excreção de íons sódio da planta. Outros parâmetros como a biossíntese de solutos e osmoprotetores compatíveis, alterações na via fotossintética, síntese de enzimas e compostos antioxidantes, geração do óxido nítrico, além da síntese de poliaminas e de outros hormônios, também auxiliam as plantas a prosperar sob ambientes estressantes (FLOWERS; COLMER, 2008).
Outra estratégia adotada pelas plantas halófitas visando a tolerância à alta concentração de sais, está o mecanismo de exclusão de íons sódio da planta, reduzindo o teor de sal nos tecidos e melhorando seu crescimento e desenvolvimento. A tolerância ao sal é atingida por meio da exclusão de íons Na+ e Cl- pelas raízes, mais precisamente nas regiões das células do parênquima do periciclo e do xilema, o córtex da raiz (principalmente a faixa caspariana), e as células do floema. Além da exclusão de sais, as plantas podem ainda acumulá-los nas raízes e nas junções raiz-caule (MUNNS et al., 2005; 2006). Além da exclusão de sais pelas raízes, existe um pequeno número de halófitas capazes de excretar sal também pelas folhas, os chamados recreto-halófitos. Esse grupo de plantas desenvolveu estruturas especializadas como bexigas de sal que possui uma célula da bexiga, com ou sem mais células-tronco, e glândulas salinas que são compostas por estruturas multicelulares capazes de eliminar o excesso de sais das plantas, possivelmente pela incapacidade de eliminar tudo pelas raízes (FLOWERS et al., 2015; YUAN et al., 2016).
A capacidade das halófitas de se adaptarem a altos níveis de salinidade é frequentemente atribuída à regulação tanto em níveis transcricionais quanto proteômicos (CHENG et al, 2013). As proteínas atuam como um importante regulador da resposta ao estresse em plantas. Além disso, as proteínas não atuam apenas como enzimas, mas também como componentes chaves nos processos de transcrição e tradução, assim, os genes de resposta ao estresse das plantas são regulados tanto no nível de RNA quanto de proteína (KOSOVÁ et al., 2011). Diversas proteínas responsivas ao estresse salino são expressas em diferentes funções celulares, como transdução de sinal, regulação do metabolismo de carboidratos, nitrogênio e energia, síntese de RNA e proteínas, regulação de ROS e homeostase redox. Portanto, a proteômica quantitativa é uma ferramenta importante a ser aplicada no estudo de estresse salino em plantas, fornecendo informações valiosas sobre os mecanismos envolvidos no processo de tolerância (BENAJAMIN et al., 2020).
Entre as plantas que demonstraram apresentar tolerância à salinidade e que permite ser utilizada como planta fitorremediadora (conforme trabalho conduzido pelo grupo - dados ainda não publicados), está a espécie Alternanthera maritima, pertencente à família Amaranthaceae, uma planta herbácea, eudicotiledônea, perene, com hastes de característica carnuda e folhas suculentas.
Em nosso trabalho, demonstramos que a espécie A. maritima tolera concentrações de 300 mM de NaCl, sem interferir significativamente nos parâmetros fisiológicos e de crescimento analisados, o que são resultados instigantes. Observamos por meio de análise tecidual de sódio, que esta espécie, sob salinidade, acumula concentrações significativas desse elemento nas folhas, despertando-nos grandes curiosidades em relação aos mecanismos fisiológicos, moleculares e anatômicos utilizados por esta espécie em particular para atingir tal tolerância.
Cientes dos impactos da salinidade no desenvolvimento, produtividade e fertilidade dos solos, estudos alternativos em busca de melhorar a qualidade física e química destes solos torna-se uma ferramenta imprescindível, em vista da necessidade de aumento produtivo devido ao crescimento populacional previsto para alguns anos. Além da fitorremediação por meio da utilização de plantas halófitas ser uma técnica bastante sustentável, também apresenta um custo reduzido, o que facilita a incorporação destas plantas em solos condenados pela salinidade.
Portanto, a fisiologia vegetal como ciência, é parte fundamental para compreender a atuação/funcionamento destas plantas em ambiente salino, e que aliado a técnicas agronômicas poderá contribuir significativamente, amenizando os efeitos da salinidade no desenvolvimento de muitas culturas e aumentando sua capacidade produtiva.

Visando a necessidade de plantas padronizadas para este experimento, serão coletadas gemas laterais de plantas de A. maritima, advindas de casa de vegetação, para o cultivo in vitro, em laboratório. Após esse período, plantas de A. maritima serão transferidas para bandejas de semeadura, contendo 288 células (67,4cm x 34,4cm x 4,7cm) e substrato do tipo PlantMax e levadas para casa de vegetação, visando aclimatização ao novo ambiente. Passados 20 dias de aclimatação das plantas, estas serão transferidas para bandejas plásticas com capacidade máxima de 20 L com solo do tipo Planossolo Háplico encontrado na região de Pelotas/RS. As plantas passarão novamente por um período de aclimatação de vinte dias, e após será iniciada a aplicação do estresse nas plantas, por meio de solução salina adicionada à solução do solo. A condutividade elétrica da solução salina será mensurada a cada 48 horas mediante a utilização de um condutivímetro portátil (Corning/CD-30), e no instante em que houver redução de 50% no conteúdo de sais dissolvidos na solução do solo, será realizado a reposição do cloreto de sódio para que a concentração salina se mantenha nos tratamentos inicialmente propostos. As plantas permanecerão em solo salinizado por um período de trinta dias, e após as variáveis propostas para cada estudo, serão avaliadas.
O delineamento experimental será o inteiramente casualizado (DIC), composto por quatro tratamentos, representados pelo controle (0 NaCl) e três diferentes concentrações de NaCl (100 mM, 200 mM e 300 mM de NaCl), sendo cada tratamento composto por cinco repetições e cada repetição composta por uma bandeja contendo vinte plantas de A. maritima. Os resultados serão submetidos à análise de variância e as médias serão comparadas pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade de erro, com auxílio do software SISVAR.

4.1 Estudo 1: Desempenho fotossintético e custo energético para a manutenção da espécie A. maritima sob altas concentrações de NaCl

4.1.1Análises de desempenho fotossintético;
Para tais análises será utilizado um analisador de gás infravermelho IRGA, com fluxo de ar de 300 mL min-1 e fonte de luz acoplada de 1200 µmol m-2 s-1. Na ocasião serão mensurados a concentração interna de carbono (Ci) (µmol m-2 s-1), condutância estomática (gs) (mol de H2O m-2 s-1), transpiração (E) (mmol de H2O m-2 s-1), taxa de fotossíntese líquida (A) (µmol de CO2 m-2 s-1), a eficiência instantânea no uso da água (EiUA - A/E) calculada relacionando-a à fotossíntese líquida com a transpiração [(µmol m-2 s-1) / (mmol de H2O m-2 s-1)] e a eficiência instantânea de carboxilação (EiC - A/Ci) [(µmol m-2 s-1) / (µmol m-2 s-1)] a partir da relação entre a fotossíntese líquida e a concentração interna de carbono.

4.1.2 Fluorescência da clorofila
A fluorescência da clorofila será mensurada no período da manhã, utilizando-se um fluorômetro portátil (LI-1600, USA), em folhas intermediárias dos ramos. Serão analisadas as variáveis fluorescência inicial (Fo), máxima (Fm), variável (Fv), eficiência quântica do FSII (Fv/Fm) e a razão (Fv/ Fo).

4.1.3 Quantificação de pigmentos
A quantificação de pigmentos como clorofila a, clorofila b, clorofila total e carotenoides será mensurada conforme metodologia descrita por Arnon (1949), e após as leituras em espectrofotômetro serão submetidas as seguintes equações: Chla = 12,7A 663nm – 2,64A 645nm (mg L -1) ; Chlb = 22,9A 645nm – 4,68A 663nm (mg L -1); Chlt = Ca + Cb (mg L -1); Carotenoides = (1000 * A470 – Chla – Chlb) / 198

4.1.4 Conteúdo relativo de água (CRA)
Para o conteúdo relativo de água será utilizada a metodologia descrita por Smart; Bingham, (1974). Para a efetuação do cálculo do CRA, será utilizada a seguinte
equação: MF – MS / MT – MS x 100

4.1.5 Cálculo da energia fixada por meio da fotossíntese
A assimilação líquida de CO2 ( A ) pode ser calculada a partir das taxas de carboxilação Rubisco ( Vc ) e oxigenação ( Vo ), e a liberação de CO2 da respiração diurna mitocondrial ( Rd ) usando a seguinte fórmula (RAWSON, 1986;WALKER et al., 2016 ): A = Vc – 0,5 Vo – Rd

4.1.6 Cálculo da energia de transporte (Movimento energizante do soluto)
A energia de um soluto X, como um íon nutriente mineral, pode ser quantificada pelo potencial eletroquímico desse soluto (μX). A energia que é liberada ou necessária para o movimento de X do solo (S) para uma célula foliar (L) é Δμ X (SL) = μ X (L) - μ X (S), com Δμ X (SL).

4.1.7 Modificações anatômicas em plantas de A. maritima submetidas a altas concentrações salinas
As alterações anatômicas serão analisadas com auxílio de microscopia eletrônica de varredura (SEM) combinada com espectroscopia de raios-X dispersiva de energia (EDS) e microscopia de luz, em parceria com outros laboratórios à serem definidos.

4.2 Estudo 2: Estudo proteômico e metabôlomico de plantas de A. maritima submetidas a altas concentrações de NaCl e Identificação in silico e análise de expressão através de RT-qPCR de transportadores de Na+ e K+

4.2.1 Sequenciamento do metaboloma
O sequenciamento do metaboloma será conforme a metodologia de Padilha et al. (2017), em Cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).

4.2.2 Extração, quantificação e digestão de proteínas de folhas de A. maritima
Três amostras biológicas (250 mg de peso fresco) de cada tratamento (controle e salinidade), cada uma contendo três folhas de três plantas diferentes, serão submetidas à extração de proteínas usando o kit Extração de Proteína Total de Plantas Kit (Sigma – Aldrich). A concentração de proteínas será medida usando 2-D Quant Kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ, Estados Unidos).
Para a digestão das proteínas, serão utilizadas três réplicas biológicas de 100 μg de cada tratamento. Antes da etapa de digestão com tripsina, as amostras de proteínas serão precipitadas usando a metodologia de metanol/clorofórmio para remover qualquer detergente das amostras (NANJO et al., 2012), seguido por ressuspensão em tampão de uréia 7 M e tioureia 2 M em bicarbonato de amônio 50 mM. Em seguida, serão realizada a digestão das proteínas utilizando a metodologia de preparação de amostra auxiliada por filtro (filter-aided sample preparation - FASP) (Wisniewski et al., 2009), com modificações descritas por Burrieza et al. (2019). Os peptídeos serão ressuspensos em solução de 100 μL de bicarbonato de amônio a 95% 50 mM, acetonitrila a 5% e ácido fórmico a 0,1%. Os peptídeos resultantes serão quantificados (A205 nm pela metodologia de proteína/peptídeo) usando um espectrofotômetro NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific).

4.2.3 Análise de espectrometria de massa e dados proteômicos
Um nano Acquity UPLC conectado a um espectrômetro de massa Synapt G2-Si HDMS (Waters, Manchester, Reino Unido) será usado para análise ESI-LC-MS/MS, conforme metodologia descrita por Buffon et al. (2021). A aquisição de espectros de massa será realizada pelo software MassLynx v4.0.
Para o processamento de dados, a metodologia utilizada será conforme descrito por Buffon et al. (2021). De maneira breve, as condições de processamento espectral e pesquisa de banco de dados serão realizadas pelo servidor global ProteinLynx (PLGS; versão 3.0.2) (Waters) e software de fluxo de trabalho ISOQuant (Distler et al., 2014). A análise comparativa de quantificação label-free será realizada usando o software ISOQuant (Distler et al., 2014), utilizando a abordagem de quantificação TOP3 (Silva et al., 2006).
Os dados serão analisados usando o teste t de Student (bicaudal) no software R. Proteínas com P <0,05 serão consideradas mais abundantes se o Log2 Fold Change (FC) for maior que 0,5 e menos abundantes se o Log2 de FC for menor que −0,5. Todos os dados proteômicos serão depositados no ProteomeXchange Consortium (Deutsch et al., 2017) por meio do repositório PRIDE3 (Perez-Riverol et al., 2019).

4.2.4 Quantificação do conteúdo de açúcar solúvel
Conforme a metodologia de Dubois et al. (1956) e leitura em espectrofotômetro no comprimento de onda de 490 nm.

4.2.5 Teor de proteína solúvel
Conforme a metodologia de Bradford (1976) e leitura em espectrofotômetro no comprimento de onda de 595 nm.

4.2.6 Estimativa do conteúdo de glicina-betaina
Seguindo a metodologia comumente realizada no laboratório de cultura de tecidos de plantas (LCTP).

4.2.7 Determinação de ascorbato (ASA)
A determinação de ascorbato (ASA) será realizada pelo método de Ma et al. (2008), e leitura em espectrofotômetro em comprimento de onda de 525 nm.

4.2.8 Determinação da capacidade antioxidante total (TAC)
O método de degradação do radical difenil-picrilhidrazil (DPPH) será determinado pelo metodologia de Sarker; Oba (2018a); Sarker et al. (2020b) será usado para estimar a atividade antioxidante da espécie.

4.2.9 Estimativa de polifenóis totais (TPC)
A extração e quantificação dos polifenóis totais serão realizadas de acordo com Sarker; Oba (2020c). Em um leitor de microplacas, a absorbância será detectada em 740 nm. Estimaremos os resultados equivalentes ao padrão de ácido gálico (GAE) expressos em µg g-1 de dw.

4.2.10 Estimativa de flavonoides totais (TFC)
Os Flavonoides totais serão quantificados e extraídos seguindo a metodologia de Sarker; Oba (2020d). Em um leitor de microplacas, a absorbância será detectada em 500 nm. Estimaremos os resultados equivalentes ao padrão de rutina (RE) representando em µg g -1 de dw.

4.2.11 Determinação de superóxido (O2•-)
O radical superóxido (O2•-) será determinado de acordo com a metodologia descrita por Li et al. (2010), mediante leitura de absorbância no comprimento de onda 530 nm em espectrofotômetro e o conteúdo de O2•- será calculado comparando as leituras obtidas com a curva padrão de O2•-, expressos em µmol O2•- g-1 MF.

4.2.12 Determinação do peróxido de hidrogênio (H2O2)
Para a determinação do conteúdo de peróxido de hidrogênio (H2O2) será utilizada a metodologia proposta por Velikova et al. (2000), mediante leitura de absorbância no comprimento de onda 390 nm em espectrofotômetro e o conteúdo de H2O2 será calculado com

Ano 1/2
• Aquisição de plantas da espécie A. maritima pelo cultivo in vitro; Estabelecimento dos experimentos; Obtenção dos dados referente ao estudo 1: Análises de desempenho fotossintético; Fluorescência da clorofila; Quantificação de pigmentos; Cálculo da energia fixada por meio da fotossíntese; Cálculo da energia de transporte (Movimento energizante do soluto); Modificações anatômicas em plantas de A. maritima submetidas a altas concentrações salinas
Ano 2/3
• Estabelecimento dos experimentos; Obtenção dos dados referente ao Estudo 2 – Sequenciamento do metaboloma; Extração, quantificação e digestão de proteínas; Análise de espectrometria de massa e dados proteômicos; Quantificação do conteúdo de açúcar solúvel ou de proteína solúvel; Determinação da capacidade antioxidante total (TAC); Estimativa de polifenóis totais (TPC); Estimativa do conteúdo de glicina-betaina; Determinação de ascorbato (ASA) Determinação da capacidade antioxidante total (TAC); Estimativa de polifenóis totais (TPC); Análise das EROs.
• Publicação de um artigo científico referente aos dados obtidos ao final do segundo ano.
Ano 3/4
• Continuidade das análises referentes ao Estudo 2 - Análise in silico dos transportadores e quantificação da expressão dos genes dos transportadores.
• Publicação de um segundo artigo científico ao final do terceiro ano
• Realização do estudo 3 em colaboração com colegas da veterinária, zootecnia, ciência de alimentos, isto é, numa proposta multidisciplinar.

Resultados e impactos esperados
Espera-se, a partir da execução deste projeto e com os resultados obtidos:
• Uma maior compreensão, entendimento dos mecanismos adaptativos utilizados por plantas halófitas para suportar altas concentrações de sais, bem como regulações fisiológicas, metabólicas e moleculares para atingir essa interessante habilidade;
• Contribuir para o conhecimento da fisiologia do estresse salino visto que essa problemática esta cada vez mais frequente em solos brasileiros, afetando o desenvolvimento de muitas culturas. Estudos como este são de grande importância em busca de estratégias sustentáveis e de baixo custo, para que possam ser utilizadas por produtores para amenizar a salinização dos solos e seus impactos sobre as plantas cultivadas;
• Disponibilização de informações genômicas, proteômicas e metabolômicas em portal on line da espécie A. maritima, possibilitando o acesso de pesquisadores a genes e/ou alelos, proteínas ou metabólitos próprios do germoplasma desta espécie.
• Formação e capacitação de recursos humanos através da elaboração de relatórios de iniciação científica, dissertações de mestrado ou teses de doutorado, de alunos dos Programas de Pós-Graduação envolvidos nesta proposta de trabalho;
• Fortalecimento de parcerias já estabelecidas entre os Programas de Pós-Graduação em Fisiologia Vegetal, bem como estabelecer novas parcerias com outras instituições de ensino e pesquisa;
• Disponibilização das informações obtidas para a comunidade científica, por meio da divulgação dos resultados em congressos, seminários e em importantes eventos técnico-científicos, bem como a publicação dos resultados em periódicos de renomado conceito.